Après l’incubation des graines d’arachide, après l’inoculation des spores d’Aspergillus flavus, utilisez une pince pour retirer les morceaux de graines de la gélose. Placez les morceaux de graines dans des flacons de billes de sept millilitres étiquetés contenant 13 billes de céramique de zirconium. Pour l’extraction des phytoalexines et des aflatoxines, en fonction de la taille de la graine, ajoutez deux ou quatre millilitres d’un mélange d’eau de méthanol dans le flacon de perles et pulvérisez à 5,5 mètres par seconde pendant 45 secondes.
Ensuite, centrifugez à 1 860 x g pendant trois minutes et recueillez le surnageant dans un flacon frais. Pour l’analyse des aflatoxines, à l’aide d’une tige de verre, coupée à un angle de 90 degrés, insérez une fritte poreuse de polyéthylène dans une colonne de polypropylène de 1,5 millilitre. À l’aide d’une cuillère sur mesure, ajoutez 50 milligrammes de gel de silice de magnésium dans la colonne.
Coiffez la colonne avec une fritte identique et poussez-la vers le bas avec une tige de verre. Ajoutez 0,5 millilitre de surnageant dans la mini-colonne emballée sur mesure et laissez l’extrait s’écouler par gravité dans un flacon en verre de quatre millilitres. Ajoutez un millilitre de mélange d’eau de méthanol dans la colonne pour éliminer les impuretés par gravité dans le même flacon.
Après avoir jeté les éluats combinés du flacon, ajoutez 1,2 millilitre d’eau acétone-acétylnitrile, mélange d’acide formique à 88 % dans la colonne pour éluer la fraction d’aflatoxine dans un flacon en verre propre. Évapore le solvant du flacon dans un flux d’azote dans un bloc chauffant à 45 degrés Celsius. Après évaporation, bouchez le flacon et laissez-le refroidir dans des dés écrasés pendant une minute.
Placez les filtres de pipette Pasteur fabriqués sur mesure dans des tubes à essai jetables et placez-les sur de la glace pour minimiser l’évaporation lors de la filtration. Dissoudre le résidu sec dans une mesure précise de 0,25 à 1,0 millilitre de mélange d’eau de méthanol. Après le vortex, transférez une aliquote de 0,2 millilitre dans le filtre.
Utilisez de l’azote gazeux pour accélérer la filtration dans un flacon d’échantillonneur automatique de 400 microlitres. Placez le flacon dans l’échantillonneur automatique UPLC et réglez le volume d’injection sur 0,1 à 3,0 microlitres. Pour la phytoalexine, transférez 200 microlitres de surnageant du flacon de centrifugeuse de sept millilitres dans un filtre à pipette Pasteur.
Après la filtration, placez un bouchon assorti avec du septum en polytétrafluoroéthylène sur le flacon. Pour la séparation des aflatoxines, mettez en œuvre un gradient à l’aide d’eau, de méthanol et d’acétylnitrile avec des compositions en pourcentage et des durées d’exécution spécifiques. Réglez le débit sur 0,45 millilitre par minute et l’autonomie sur 9,5 minutes.
Dans le réchauffeur de colonne du système, réglez la température de la colonne sur 40 degrés Celsius. Pour quantifier les aflatoxines, réglez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission à 362 et 440 nanomètres, respectivement. Ensuite, à l’aide de la méthode de la courbe d’étalonnage et du manuel du logiciel UPCL, effectuez l’analyse pour déterminer les concentrations d’aflatoxine dans les échantillons de test.
Pour la séparation des stilbénoïdes, utilisez un gradient composé d’eau, de méthanol et d’acide formique à 88 % avec des conditions de pourcentage et des temps spécifiques. Réglez le débit sur 0,5 millilitre par minute et l’autonomie sur 12 minutes. À l’aide de la méthode de la courbe d’étalonnage, déterminez les concentrations de stilbénoïdes et comparez les zones de pic de l’échantillon d’essai avec des étalons purs et authentiques.
La méthode de quantification de l’aflatoxine basée sur l’UPLC permet d’obtenir une quantification sensible de l’aflatoxine B1 avec une limite de deux picogrammes par injection. L’extrait purifié de graines récoltées sur une espèce sauvage d’Areca a montré une quantification sans ambiguïté des aflatoxines. L’approche de la colonne de gel de silice de magnésium élimine efficacement les impuretés de la fraction d’aflatoxine et démontre une grande efficacité de quantification par rapport aux méthodes précédentes.
De plus, cette méthode aide également à la quantification des phytoalexines d’arachide.
