Commencez par retirer de l’incubateur la parabole contenant les HIE différenciés. Pour synchroniser l’horloge moléculaire des entéroïdes, ajoutez deux microlitres de 100 micromolaires de dexaméthasone dans la boîte et incubez à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant une heure. Pendant l’incubation, réglez le pourcentage de dioxyde de carbone et la température du luminomètre à 5 % et 37 degrés Celsius respectivement.
Après la synchronisation de l’horloge, remplissez les entéroïdes avec trois millilitres de milieu de différenciation préchauffé contenant 200 micromolaires de D-Lucifer. Placez le plat sur une table à huit puits du luminomètre d’incubation et couvrez la table du plat d’échantillonnage avec son couvercle. Placez deux chambres d’humidificateur avec un mouchoir humide ou une éponge sur le dessus de la table de plat d’échantillonnage et fermez le couvercle de la machine.
Sur le logiciel de bioluminescence, cliquez sur l’onglet condition pour ajuster les paramètres du nombre de plats, du temps de mesure, du traitement en arrière-plan et du type de filtre. Cliquez ensuite sur OK pour enregistrer les paramètres. Pour démarrer l’expérience, cliquez sur l’onglet Exécuter, puis sur le bouton Démarrer.
Cliquez ensuite sur les onglets Bruit brut, Filtré ou Distendance, en haut de l’écran pour observer les signaux des données sélectionnées. Après l’enregistrement, cliquez sur le bouton d’arrêt pour arrêter la course. Allez dans l’onglet Fichier, sélectionnez Enregistrer sous et enregistrez les données au format Kronos.
Enfin, cliquez sur fichier et sélectionnez exporter au format Excel pour exporter les données vers une feuille de calcul. L’enregistrement de la bioluminescence d’un a évalué la rythmicité circadienne des HIE dans des conditions d’enrichissement en cellules souches et d’induction de la différenciation. L’analyse de transformation rapide de quatre ans a révélé que dans des conditions différenciantes, la bioluminescence de la luciférase B MAL one présentait des oscillations circadiennes robustes avec une périodicité moyenne de 22,92 heures.
En revanche, les HIE ont montré des rythmes circadiens perturbés dans des conditions enrichies en cellules souches.
