Pour commencer, ajoutez un colorant orange 500x à une solution PBS pour obtenir différents ratios de colorant, lancez le logiciel d’acquisition de données sur le bureau. Cliquez sur Instrument, puis choisissez le modèle de microplaque correspondant, puis sélectionnez OK. Cliquez sur les paramètres d’acquisition et choisissez Fluorescence.
Sous l’interface de longueur d’onde, réglez la fonction lambda sur 470 nanomètres et 570 nanomètres, puis appuyez sur OK. Pipeter 100 microlitres de chaque concentration de colorant orange dans les puits d’une plaque à 96 puits. Placez la plaque dans l’étage de détection de l’instrument de lecture de microplaques fluorescentes.
Cliquez sur l’icône Lire sur le logiciel et mesurez la fluorescence de chaque concentration de colorant 13 fois à température ambiante avec un intervalle de deux minutes. Après chaque détermination, cliquez sur l’icône Exporter, puis sélectionnez Exporter au format XML XLS TXT. Choisissez Toutes les plaques.
Sélectionnez ensuite Plaque dans le format de sortie, puis cliquez sur OK pour enregistrer les données au format XLS pour une analyse plus approfondie. Maintenant, allumez le chauffage numérique en secouant le bain sec. Réglez la température de chauffage à 35 degrés Celsius et le temps de chauffage à deux minutes.
Préparez le taux de dilution optimal du colorant dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre. Ensuite, placez-le dans le bain sec de chauffage numérique en secouant pendant deux minutes. Maintenant, ajoutez 100 microlitres de PBS et des solutions de coloration dans les puits de la plaque.
Placez la plaque dans l’étage de détection de l’instrument. Cliquez sur l’icône Lire dans le logiciel d’acquisition de données. Réglez la température de chauffage à 40 degrés Celsius et le temps de chauffage à deux minutes.
Maintenant, pipetez la solution de colorant dans la plaque dans le microtube à centrifuger de 1,5 millilitre. Chauffez-le dans le chauffage numérique en secouant le bain sec pendant deux minutes. Répétez l’ajout des solutions de colorant, en exportant les données résultantes pour tester l’absorbance de la solution de colorant à des incréments de température de cinq degrés de 35 à 95 degrés Celsius.
Combinez la solution protéique CD40 avec le PBS pour obtenir des concentrations finales de 5, 10, 15 et 20 microgrammes par microlitre. Ensuite, combinez le colorant orange avec le PBS pour obtenir une concentration finale de un est à 500. Évaluer l’absorbance de la solution de protéine CD40 à des incréments de température de cinq degrés de 35 à 95 degrés Celsius.
Enregistrez les données sous forme de fichiers XLS, puis calculez le point de fusion ou la valeur TM à l’aide du logiciel d’analyse de données. Ensuite, mélangez CD40 et Umbelliferone dans la solution PBS. Ensuite, pipetez le colorant orange dans le PBS pour obtenir une concentration de solution de un est à 500.
Mesurez l’absorbance de la solution de complexes ombellifères CD40 à des incréments de température de cinq degrés de 35 à 95 degrés Celsius. Le colorant orange a toujours montré une excitation de fluorescence stable à la fois à température ambiante et à des températures élevées. Un rapport de dilution optimal de un est à 500 a été déterminé.
Une valeur TM stable de 51,82 degrés Celsius était détectable à une concentration de 15 microgrammes par millilitre, qui a diminué à 45,79 degrés Celsius avec une augmentation de la concentration en protéine CD40.
