Centrifugez l’échantillon de protéine marqué par épitope à 5 000 G pendant 30 secondes à 4 degrés Celsius. Attendez une minute sur la glace pour permettre aux perles de se stabiliser. Jetez ensuite le surnageant.
Ajoutez un millilitre de tampon de lyse protéique contenant un inhibiteur de protéase dans le tube et mélangez le contenu. Faites pivoter le tube sur un rotateur pendant environ 30 secondes à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes. Centrifugez à nouveau et placez le tube sur de la glace pendant une minute pour niveler les billes avant de jeter le surnageant.
Maintenant, ajoutez 10 microlitres de tampon d’échantillon et faites bouillir l’échantillon à 98 degrés Celsius pendant 10 minutes. Centrifugez l’échantillon à 5 000 G pendant 30 secondes à 4 degrés Celsius. Placez une colonne dans un nouveau tube à faible absorption de protéines et transférez le gel dans une colonne à l’aide d’une pipette avec une pointe coupée.
Centrifuger à 9, 730G pendant une minute à 4 degrés Celsius et recueillir le débit. Placez le gel dans la chambre d’électrophorèse et ajoutez le tampon tris-glycine-SDS jusqu’au volume approprié autour du gel. Chargez les échantillons de protéines éluées sur un gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium.
Effectuez une électrophorèse à 100 volts et 400 milliampères. Transférez le gel sur une membrane de fluorure de polyvinylidène et épongez la membrane avec du lait écrémé à 5 % pendant une heure à température ambiante. Lavez la membrane trois fois avec du monolaurate de polyoxyéthylène sorbitan PBS sur un agitateur à toute vitesse pendant cinq minutes.
Enfin, incubez la membrane avec l’anticorps primaire pendant la nuit sur un agitateur à 4 degrés Celsius. Dans les cellules HEK 293 transfectées, l’immunotransfert a confirmé l’association entre DYKDDDDK-PRDM16 et HA-EHMT1 dans les groupes transfectés avec DYKDDDDK-PRDM16 et HA-EHMT1.
