Pour commencer, placez une aliquote de liposomes dans un bain-marie à température ambiante pour décongeler les vésicules. Pré-équilibrez une extrudeuse équipée d’un filtre avec tampon A.Ensuite, passez les liposomes décongelés dans l’extrudeuse 13 fois. Collectez les liposomes extrudés dans un tube en plastique, en minimisant le volume mort.
Ensuite, pipetez un millilitre de la solution liposomale diluée dans une cuvette transparente. Mesurez sa densité optique initiale à 540 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre. Ajoutez 50 microlitres de 10% de Triton X-100 aux liposomes.
Lorsque la solution a atteint sa densité optique maximale, la titrer contre Triton X-100 jusqu’à ce qu’une densité optique de 60 % de saturation soit obtenue. Versez les vésicules déstabilisées par le détergent dans le tube en plastique. Ensuite, ajoutez la protéine membranaire purifiée aux liposomes déstabilisés jusqu’à ce qu’un rapport souhaité de 400 à 1 soit obtenu.
Nutez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Ajoutez ensuite 200 milligrammes de billes de polystyrène démouillées denses pour éliminer le détergent. Fixez maintenant une colonne d’écoulement par gravité vide de 10 millilitres au-dessus d’un tube d’ultracentrisation vide de 6,5 millilitres placé sur de la glace.
Versez l’échantillon dans la colonne d’écoulement par gravité et collectez les protéoliposomes dans le tube d’ultracentrifugation. Ajoutez 0,5 millilitre de tampon A aux billes. Recueillir le filtrat dans le tube d’ultracentrifugation.
Ensuite, placez les liposomes dans une ultracentrifugeuse pour les concentrer. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension les protéoliposomes granulés dans un volume total de 200 microlitres de tampon A.Divisez le volume final des protéoliposomes en trois aliquotes. De faibles quantités de Triton X-100 ont initialement entraîné une augmentation de l’absorbance à 540 nanomètres.
Une addition supplémentaire a entraîné la solubilisation partielle des vésicules. Au niveau de notre Rsol, les liposomes ont été complètement solubilisés.
