Pour commencer, pipetez 92,7 microlitres de tampon A dans un tube vide de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite le DTT, l’ADP de sodium, le chlorure de magnésium, la L-ornithine et les enzymes. Après avoir délicatement mélangé la solution, ajoutez-la sur 66,6 microlitres de protéoliposomes préformés.
Congelez le mélange dans de l’azote liquide, puis décongelez-le dans un bain d’eau glacée à environ 10 degrés Celsius. Faites passer le mélange d’encapsulation dans l’extrudeuse 13 fois à travers un filtre pré-équilibré avec le tampon A, le DTT, l’ADP de sodium et la L-ornithine, et collectez la solution extrudée dans un tube de 1,5 millilitre. Pour déterminer la synthèse de l’ATP, pipeter le tampon K, les protéoliposomes et les ionophores dans une cuvette de quartz noir avec une petite fenêtre.
Préchauffez l’échantillon à 30 degrés Celsius dans un fluorimètre. Maintenant, acquérez les spectres d’excitation de la HR perceval. Lorsque le signal de la sonde est constant, ajoutez un excès de L-arginine et de glycérol pour démarrer le réseau métabolique et suivre la réaction dans le temps. L’ajout de L-arginine aux protéoliposomes a entraîné une forte augmentation du rapport de la fluorescence HR perçue à 500 et 430 nanomètres d’excitation.
