Pour commencer, allumez l’armoire à flux d’air laminaire, ce qui lui permet de se stabiliser pendant trois minutes. Nettoyez et désinfectez aseptiquement les surfaces internes de l’armoire à l’aide des agents de désinfection suivants. Après avoir désinfecté tout matériel qui entrera dans l’armoire, placez des serviettes et des gants en nitrile dans l’armoire.
Éteignez ensuite l’armoire et exposez-la à la lumière ultraviolette pendant 15 minutes. Après l’irradiation, redémarrez l’armoire. Placez les réactifs de conception d’amorce dans une glacière remplie de glaçons.
Après l’avoir désinfecté avec de l’éthanol à 70%, placez le récipient à l’intérieur de l’armoire. Préparez l’amplification isotherme médiée par boucle, ou mélange LAMP, dans un tube de microcentrifugation de 0,6 millilitre. Pipeter le mélange pour l’homogénéiser.
Ensuite, incubez les tubes fermés dans un bloc chauffant à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, refroidissez les tubes dans une glacière en polystyrène remplie de glace pendant cinq minutes. Après refroidissement, placez les tubes dans l’armoire à flux laminaire.
Pour compléter le mélange LAMP, ajoutez quatre microlitres d’ADN polymérase, suivis d’un microlitre de transcriptase inverse. Pour effectuer une détection colorimétrique, ajoutez le bleu de dihydroxynaphtol. Après l’ajout du réactif, pipetez chaque solution pour bien mélanger les réactifs LAMP.
Ensuite, pipetez 22 microlitres de la solution dans des tubes PCR, en faisant attention de ne pas créer de bulles. Pour le contrôle négatif, ajoutez trois microlitres d’eau de pyrocarbonate de diéthyle à 0,1 %. Gardez de côté tous les tubes restants pour l’ajout de matériel génétique.
Ensuite, retirez tous les matériaux de l’armoire. Après avoir désinfecté les surfaces de l’armoire avec de l’éthanol à 70 %, éteignez-le. Dans une zone séparée, ajoutez trois microlitres de l’échantillon dans chaque tube PCR et pipetez bien avec une micropipette de 20 microlitres pour bien homogénéiser.
Avant d’initier la réaction colorimétrique, utilisez un appareil photo de haute qualité pour prendre des photos des tubes PCR. Maintenant, effectuez la réaction à l’aide d’un thermocycleur et d’un bain-marie. Pour le thermocycleur, placez les tubes dans le bloc de réaction et installez un profil thermique sur l’équipement.
Si vous utilisez le bain-marie, placez solidement les tubes dans des récipients circulaires, puis placez ces récipients dans le bain-marie à 66,3 degrés Celsius pendant 60 minutes. Après le temps de réaction, retirez les tubes et rangez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. Si une réaction colorimétrique a été réalisée, capturez des images de la PCR avec une caméra de haute qualité.
Un gradient de température a démontré que la température de fusion optimale était de 66,3 degrés Celsius. La concentration de l’enzyme BST 3.0 a été optimisée à 3,2 unités internationales par microlitre. Pour définir la stratégie colorimétrique, le rouge de phénol dans les colorants rouges neutres a été évalué.
Cependant, aucun changement de couleur n’a été observé après amplification. La normalisation de différentes concentrations de bleu d’hydroxynaphtol a été effectuée, le changement optimal se produisant avec 125 micromoles de bleu d’hydroxynaphtol. Les échantillons amplifiés ont montré un changement de couleur en fonction de leur concentration.
L’amplification de l’échantillon a été confirmée par électrophorèse.
