Pour commencer l’analyse cytométrique en flux, réglez d’abord le laser de 785 nanomètres sur une puissance de cinq milliwatts pour les mesures en fond noir. Utilisez un objectif 60X avec une ouverture numérique de 0,9. Sélectionnez ensuite le réglage haute sensibilité et réglez la vitesse sur faible.
Pour assurer la stabilité du cordon d’étalonnage, appuyez sur le bouton Lecture dans la boîte fluidique et examinez les images du talon, qui doivent apparaître nettes et claires. Générez un nouveau nuage de points dans la zone de l’espace de travail en sélectionnant Nouveau nuage de points. Sélectionnez ensuite la zone du canal Brightfield qui correspond à l’intensité du canal SSC et excluez les billes d’étalonnage qui s’exécutent simultanément dans l’échantillon.
Ensuite, appuyez sur le bouton Load et positionnez un tube contenant l’échantillon de lactobacilles dans le support. Dans la zone Paramètres d’acquisition, entrez le nom de l’échantillon et spécifiez l’emplacement de stockage des données. Définissez le nombre d’événements à collecter, généralement compris entre 10 000 et 20 000 événements.
Maintenant, commencez le processus d’acquisition en cliquant sur le bouton Enregistrer situé dans la boîte Acquisition. Le processus s’arrêtera une fois le volume d’événements spécifié atteint. Appuyez sur le bouton Retour pour décharger le tube et le retirer du support comme indiqué dans la fenêtre contextuelle.
Après avoir répété le processus pour tous les échantillons, enregistrez le modèle pour maintenir l’uniformité de l’acquisition des données. Pour l’analyse des données, pour charger le fichier brut dans le logiciel d’analyse, cliquez sur Fichier et ouvrez le fichier rif. Dans la fenêtre qui s’ouvre, sélectionnez Utiliser l’analyse d’acquisition, puis cliquez sur OK. Ensuite, pour créer un histogramme du carré moyen de la racine du gradient, cliquez sur le bouton Nouvel histogramme et choisissez la population de l’acquisition à analyser.
Sous la fonction Axe X, sélectionnez Dégradé RMS du canal Fond clair. Ensuite, placez une porte pour exclure les événements non ciblés en cliquant sur le bouton Créer une région de ligne dans la zone d’analyse. Créez un nuage de points de la zone en fonction des proportions en cliquant sur le bouton Nouveau nuage de points dans la zone d’analyse.
Sélectionnez la population ciblée dans la fenêtre Nouveau nuage de points. Sélectionnez ensuite la zone du canal Fond clair pour la fonction Axe X. Choisissez le rapport hauteur/largeur de la fonction Axe Y.
Dessinez une porte sur le nuage de points à l’aide du bouton Créer un rectangle en fonction de la valeur de surface de la population d’événements agrégés. De même, dessinez une autre porte pour la population des célibataires et des petits agrégats. Enregistrez votre analyse de données en tant que modèle en cliquant sur l’onglet Fichier, en choisissant Enregistrer en tant que modèle ast, puis ouvrez l’exemple de fichier suivant sous le même modèle pour créer le fichier d’analyse de données.
Pour mesurer la distribution de la taille agrégée, commencez par tracer un histogramme de la zone de la population des événements d’agrégation. Enregistrez l’analyse des données en cliquant sur le fichier et en sélectionnant l’option Enregistrer en tant que modèle. Après l’enregistrement, ouvrez le fichier d’exemple suivant sous le même modèle que celui du fichier d’analyse de données.
Des cellules uniques, de petits agrégats, de grands agrégats et des chaînes ont été observés chez LGG et L. paracasei, mais il n’a pas été possible de distinguer les chaînes des agrégats plus grands. Des variations significatives dans les caractéristiques d’agrégation des différentes souches de LAB ont été observées en réponse aux sucres fermentescibles ou non fermentescibles.
