Pour commencer, placez la souris euthanasiée en décubitus dorsal sur la planche de dissection. À l’aide de goupilles en T de dissection, fixez les repose-pieds de la souris à la carte. Avec des ciseaux de dissection chirurgicale, incisez le bas-ventre et coupez jusqu’au menton.
Après avoir séparé la peau de la muqueuse péritonéale, étirez-la perpendiculairement au tronc et épinglez-la. À l’aide d’une pince émoussée, retirez soigneusement les ganglions lymphatiques cervicaux, axiaux, brachiaux et inguinaux, ainsi que la rate, et placez-les dans une crépine cellulaire de 70 micromètres contenant deux millilitres de milieu R9. Pour préparer une suspension à cellule unique, tournez l’outil de perturbation tissulaire d’un demi-tour dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre à plusieurs reprises.
Lavez la passoire avec cinq millilitres de fluide. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez-la. Après avoir décanté le surnageant, ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse dans le tube pour éliminer les globules rouges.
Au bout d’une minute, mélangez les cellules avec 9,5 millilitres de milieu R9. Centrifugez le tube. Et décantez soigneusement le surnageant.
Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres de milieu à sélection négative contenant des anticorps anti-CMH2 et anti-CD4, et placez le tube dans une bascule pendant 30 minutes. Après avoir granulé les cellules à 270G pendant cinq minutes, décantez le surnageant. Simultanément dans un tube conique de 15 millilitres, laver 200 microlitres de billes d’anti-rat de mouton et d’immunoglobuline G dans sept millilitres par milieu.
Placez le tube sur un aimant et retirez le fluide. Après avoir lavé deux fois de plus, remettez les billes en suspension dans sept millilitres de milieu R9. Ensuite, mélangez sept millilitres de suspension de billes avec la pastille de cellule et incubez le tube sur une bascule.
Pour retirer les cellules liées aux billes d’anticorps, placez le tube conique directement sur l’aimant pendant trois minutes. Aspirez la suspension de la cellule dans un nouveau tube de 15 millilitres, en maintenant le tube sur l’aimant. Granulez les cellules CD8 positives enrichies et lavez-les trois fois dans un milieu.
