Pour commencer, effectuez une imagerie en accéléré de lymphocytes T vivants isolés de tissus lymphoïdes secondaires murins. Pour l’analyse de la migration des lymphocytes T, ouvrez le logiciel Velocity et créez une nouvelle séquence d’images. Sélectionnez et déplacez les films de microscopie vidéo en accéléré de tous les temps vers la zone bleue de Velocity.
À l’aide de l’outil d’amélioration du contraste, modifiez la luminosité et le contraste, puis ajustez la taille de l’image à 0,325 micromètre pour un grossissement de 20x et de 0,65 micromètre pour un grossissement de 10x. Après avoir configuré la séquence pour définir des points temporels, allez dans l’onglet mesure et décochez tous les points temporels. Ensuite, trouvez des objets en utilisant l’intensité et faites glisser la barre vers la droite du pic.
Pour éviter les débris cellulaires, excluez toutes les cellules de moins de 10 micromètres et de plus de 100 micromètres de diamètre. Cochez Ignorer les objets statiques puis Joindre automatiquement les pistes interrompues. Pour enregistrer un nouveau protocole, accédez à mesures.
Cliquez sur enregistrer le protocole, puis sur le nom nouveau protocole. Dans l’onglet mesure, cliquez sur mesurer tous les points temporels et trier les pistes par intervalle de temps de haut en bas. Après avoir enregistré les numéros d’identification des pistes pour les cellules avec de bonnes traces, exportez le fichier sous forme de texte séparé par des virgules et transférez les données vers le logiciel d’analyse souhaité.
Pour effectuer un suivi manuel, ouvrez l’image J, allez dans les plugins et sélectionnez suivi et suivi manuel. Définissez les intervalles de temps X par Y calibrage, taille de pixel et calibrage Z. Ensuite, cliquez sur ajouter une piste pour démarrer le suivi de chaque cellule.
Sélectionnez une cellule au premier point temporel et continuez-la à travers tous les points temporels. Enfin, cliquez sur la piste de fin. Le suivi cellulaire assisté par logiciel a caractérisé les comportements migratoires des lymphocytes T individuels activés, comme l’indiquent les lignes de couleurs différentes.
