Avant de connecter la tubulure stérilisée à la biopuce, rincez d’abord la tubulure avec 200 microlitres de PBS suivis de 200 microlitres de milieu EC. Après avoir rincé les chambres supérieure et inférieure avec un milieu de culture cellulaire fraîchement préparé, insérez le réservoir du côté de la sortie de la biopuce et connectez le réservoir avec la tubulure à l’entrée de la biopuce. Pour une profusion en milieu circulaire, connectez la tubulure au réservoir et à la biopuce.
Remplissez maintenant le réservoir avec 500 microlitres de fluide EC. Connectez la biopuce à la tubulure pour commencer la profusion à un débit de 21 microlitres par minute. Le lendemain, arrêtez la profusion et videz les réservoirs.
Sous une enceinte de sécurité stérile, pipetez 500 microlitres de milieu EC dans les réservoirs et rincez doucement la chambre inférieure avec 200 microlitres de milieu RPMI plus. Redémarrez ensuite la perfusion à un débit de 21 microlitres par minute. Pour établir une interface air-liquide du jour 12 au jour 14, ouvrez les bouchons de la chambre inférieure et absorbez soigneusement le fluide jusqu’à ce qu’une bulle d’air soit visible.
Après s’être assuré que tout le liquide du canal et de la chambre est éliminé, fermez soigneusement les orifices, remplissez le réservoir avec un milieu EC vasculaire fraîchement préparé et continuez la culture de profusion uniquement dans la chambre supérieure jusqu’au 14e jour. Déconnectez les biopuces du système d’écoulement. Après avoir retiré la tubulure, examinez les couches cellulaires de la biopuce au microscope pour détecter la confluence cellulaire.
Lavez les cavités des biopuces avec du PBS pour retirer le milieu de culture cellulaire. Ajouter 300 microlitres de solution de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS dans la chambre supérieure et 200 microlitres dans la chambre inférieure. Après 10 minutes d’incubation, laver la chambre trois fois avec du PBS.
Pour la perméablation, ajouter 300 microlitres de 0,25% Triton X 100 dans du PBS et incuber pendant 30 minutes, après lavage au PBS, pipeter 300 microlitres de 3% d’albumine sérique bovine dans du PBS dans les deux chambres et incuber pendant une heure. Pour la coloration par immunofluorescence, préparer 50 microlitres de solutions d’anticorps en utilisant 3 % de BSA pour chaque membrane en utilisant des taux de dilution appropriés. Pour accéder aux cellules à l’intérieur de la biopuce, faites une coupe précise à l’extérieur de la cavité et retirez la feuille de liaison.
À l’aide d’un scalpel, découpez la membrane en retirant les bords scellés à la biopuce. Après avoir divisé la membrane en deux morceaux, collectez les morceaux de membrane à l’aide d’une pince à épiler et placez-les sur une lame microscopique pour la coloration, ajoutez 50 microlitres de solution d’anticorps à chaque morceau de membrane et incubez pendant la nuit à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière. Après avoir lavé la membrane trois fois avec du PBS, ajoutez une goutte de support de montage sur la lame étiquetée et placez la membrane correspondante.
Ajoutez une goutte de support de montage sur le dessus de la membrane et placez un verre de protection. La coloration par immunofluorescence des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine a révélé des altérations morphologiques et l’expression de la marcoprotéine après 14 jours de co-culture. Du côté vasculaire, l’expression cohérente au niveau des cellules endothéliales suggère une confluence et la formation d’une barrière endothéliale.
Le côté épithélial a été évalué pour l’expression de l’ecaherrine et de la protéine A du tensioactif, indiquant l’intégrité et la fonction de l’épithélium alvéolaire.
