Pour commencer, transférez cinq millilitres d’un surnageant de culture acidifié de pseudomonas aeruginosa dans un tube en polypropylène de 50 millilitres. Ajoutez cinq millilitres de mélange de chloroforme et de méthanol dans ce tube. Retournez le tube trois fois pendant 30 secondes pour agiter et mélanger la solution.
Laisser le tube sans inversion pendant deux minutes entre chaque agitation. Centrifugez le tube pendant 10 minutes à 3000 G à quatre degrés Celsius, puis transférez la phase organique dans un tube propre. Laissez le tube dans une hotte d’extraction jusqu’à ce qu’il soit sec.
Ensuite, à l’aide d’une pipette de 10 microlitres, appliquez cinq microlitres des échantillons sur une plaque CCM. Pour préparer la phase liquide, mélangez 26 millilitres de chloroforme, six millilitres de méthanol et 0,8 millilitre d’acide acétique à 20 %. Placez le mélange de solvants dans une chambre TLC fermée pendant au moins 10 minutes pour le saturer.
Transférez la plaque TLC dans la chambre, en évitant tout contact avec les points d’application de l’échantillon. Laissez la plaque TLC dans la chambre fermée jusqu’à ce que le solvant atteigne un centimètre avant le bord de la plaque. À ce stade, retirez la plaque et laissez-la sécher.
Pour détecter la présence de rhamnolipides, vaporisez une solution d’alpha-naphtol sur la plaque de la hotte d’extraction, puis placez une plaque pulvérisée dans un four à 85 degrés Celsius pendant plusieurs minutes jusqu’à ce que la marque rosâtre du lipide de rhamnolipide soit visible. Les trois souches de Pseudomonas aeruginosa produisent des quantités différentes de mono et de di-rhamnolipides.
