Pour commencer, ouvrez le logiciel et sélectionnez l’option permettant de créer un nouveau fichier ADN. Préparez la séquence du gène PRRSV à partir du NCBI et cliquez sur OK pour générer les fichiers de séquence. Analysez la séquence et marquez les jonctions de fragments.
Identifiez toutes les jonctions avant de concevoir les amorces de séquence spécifiques pour les fragments. Cliquez ensuite sur Amorces et choisissez Ajouter une amorce. Collez la séquence spécifique et ajoutez des séquences de chevauchement du vecteur aux cinq premiers nucléotides premiers de l’amorce.
Nommez l’amorce avant et cliquez sur Ajouter une amorce au modèle pour incorporer l’amorce conçue dans le modèle. Marquez ensuite les jonctions de fragments et concevez l’amorce de séquence spécifique inverse des fragments. Encore une fois, accédez à Amorces et sélectionnez Ajouter une amorce.
Entrez la séquence spécifique. Ajoutez le site de restriction aux cinq premiers nucléotides premiers. Incluez également 20 à 40 paires de bases de séquences de surplomb de vecteurs sur les cinq premiers nucléotides premiers du site de restriction.
Nommez l’amorce inversée et sélectionnez Ajouter l’amorce au modèle. Ensuite, mettez en place six réactions PCR individuelles à l’aide des six fragments et des paires d’amorces conçues. Exécutez la PCR en suivant un protocole en trois étapes, comme illustré ici.
Une fois la PCR terminée, pipetez un microlitre de six tampons de chargement xDNA avec cinq microlitres du produit PCR. Mélanger et centrifuger brièvement. Analysez les échantillons à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %.
Pour construire un gène complet, des fragments insérés de SDRP ont été amplifiés à l’aide de six réactions PCR. La taille des fragments a été confirmée par électrophorèse sur gel d’agarose.
