Commencez par linéariser le vecteur. Préparez le mélange réactionnel contenant des enzymes de restriction spécifiques à température ambiante. Utilisez un kit d’extraction de gel pour purifier les vecteurs linéarisés, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes.
Ensuite, assemblez la réaction de clonage et d’assemblage sans couture de l’exon R pour sous-cloner le gène PRRSV. Ajustez le volume total de réaction à 10 microlitres avec de l’eau déminéralisée stérilisée. Ensuite, mélangez soigneusement.
Incuber le mélange dans un thermocycleur pendant 15 à 60 minutes à 50 degrés Celsius. Ensuite, conservez les échantillons sur de la glace. Après avoir transformé le vecteur en cellules compétentes, prélevez huit colonies dans 20 microlitres de milieu LB contenant de la kanamycine.
Mettre en place une réaction PCR de colonie pour analyser les transformants. Un vecteur de surexpression du SDRP de pleine longueur a été obtenu en introduisant le premier fragment du SDRP dans le vecteur pVAX1, créant ainsi pVAX1-F1. Des cycles successifs de recombinaison à l’aide d’enzymes de restriction spécifiques ont abouti à l’incorporation de fragments deux à cinq, visualisée par une augmentation de la taille du plasmide.
