Commencez par effectuer le test MM QPCR pour la mesure de la longueur des télomères. Ouvrez ensuite le logiciel et sélectionnez la fonction de configuration de la plaque. Après cela, choisissez l’option afficher ou modifier la plaque dans le menu déroulant.
Mettez maintenant en surbrillance tous les puits sur la plaque. Cliquez sur sélectionner des floraphores. Cochez la case Cyber et assurez-vous que toutes les autres cases ne sont pas cochées.
Cliquez ensuite sur OK pour confirmer. Tout en maintenant la mise en évidence de tous les puits, localisez et cochez la case à côté de cyber, à côté du mot charge, pour étiqueter tous les puits avec cyber. Mettez maintenant en surbrillance les trois puits de contrôle non gabarits positionnés en haut ou en bas de la dilution en série de contrôle standard.
Ensuite, dans le menu du type d’échantillon à droite, sélectionnez NTC. Mettez en surbrillance les 21 puits qui composent la dilution en série de contrôle standard et choisissez standard dans le menu des types d’échantillons. Pendant que ces puits sont toujours sélectionnés, cliquez sur réplication technique, dans le menu de taille de la réplication, choisissez-en trois.
Sélectionnez ensuite Horizontal et cliquez sur Appliquer. Après cela, faites défiler jusqu’à la section des séries de dilution et entrez deux dans le champ du facteur de dilution. Pour la plaque P1, entrez deux fois 10 à la puissance moins trois dans le champ de concentration de départ.
Cochez ensuite la case de décroissance et cliquez sur Appliquer pour confirmer les paramètres. Pour la plaque P2, entrez 3,13 fois 10 à la puissance moins cinq dans le champ de concentration de départ. Assurez-vous de cocher la case d’augmentation, puis sélectionnez Appliquer pour finaliser la configuration.
Mettez maintenant en surbrillance les colonnes correspondant à la bandelette PCR A dans le menu du type d’échantillon, choisissez inconnu, puis sélectionnez la réplication technique. Dans le menu de la taille de réplique, choisissez-en trois et choisissez l’horizontale avant de cliquer sur Appliquer. Cliquez sur OK en bas à droite de la fenêtre de l’éditeur de plaques.
Confirmez les modifications en cliquant sur oui lorsque vous y êtes invité. Ensuite, vérifiez que les courbes de l’onglet Quantification semblent appropriées pour l’étape neuf et l’étape 12, et que les valeurs d’efficacité entre ces deux étapes ne divergent pas de plus de 10 %Pour P1, sélectionnez l’étape neuf et mettez en surbrillance les 21 puits correspondant à la courbe standard. Copiez les valeurs CQ dans le coin inférieur droit de la fenêtre du logiciel.
Ouvrez ensuite le modèle de feuille de données des télomères et collez ces valeurs dans la colonne B de la feuille standard. Ensuite, entrez la valeur de pente de l’étape neuf dans la cellule C quatre de la feuille standard, vérifiez que le coefficient de variation de chaque triplicat de dilution standard est inférieur à 0,1. Sur CFX, excluez de l’analyse tous les points de données aberrants qui font qu’un ensemble de triplets sort de la plage. Maintenant, vérifiez que seuls les 72 puits d’échantillonnage du fichier d’analyse P1 sont surlignés en bleu dans l’onglet de quantification.
Ensuite, à la neuvième étape, copiez les valeurs CQ et SQ qui se trouvent dans le coin inférieur droit de la fenêtre du logiciel et collez-les dans la feuille d’échantillons P1 en commençant par la cellule D3. À l’aide de CFX maestro, assurez-vous que toutes les valeurs CQ des échantillons analytiques se situent dans la plage des valeurs CQ les plus basses et les plus élevées de la courbe standard. Dans la feuille Excel, vérifiez que la concentration de départ dans le NTC est inférieure à 5 % de la quantité moyenne d’ADN dans les puits d’échantillon. Pour le contrôle de la qualité au niveau de l’échantillon, examinez les écarts-types et les coefficients de variation dans les colonnes J et K sur les feuilles P1 et P2 des échantillons.
Vérifiez que les CV interplaques de chaque échantillon dans la feuille P1 par rapport à la feuille P2, en particulier dans la colonne G, ne dépassent pas 0,05. Si le CV interplaque d’un échantillon est supérieur à ce qui est acceptable, retirer jusqu’à un triplet du calcul pour chaque échantillon. Pour le contrôle de la qualité au niveau de la plaque, vérifiez que la variation moyenne entre les plaques de tous les échantillons de chaque plaque est inférieure à 0,05.
Si le CV interplaque d’un échantillon est supérieur à ce qui est acceptable, retirer jusqu’à un triplet du calcul pour chaque échantillon. Pour un contrôle qualité supplémentaire au niveau de la plaque, vérifiez que la variation globale entre les plaques P1 par rapport à la feuille P2 est inférieure à 0,06.
