Commencez par préparer un échantillon avec un complexe protéine-ligand. Ensuite, à l’aide d’une pipette, transférez soigneusement 0,6 millilitre de la solution préparée dans un tube RMN de cinq millilitres. Pour régler l’instrument RMN à la température requise, utilisez la commande EDT pour ouvrir le moniteur de contrôle de la température et régler la température souhaitée.
Ensuite, placez l’échantillon sur le passeur d’échantillons. À l’aide d’un passeur d’échantillons, insérez l’échantillon dans l’aimant et exécutez la commande sx, suivie du numéro de position, N, correspondant à la position du tube RMN dans le plateau de l’échantillonneur automatique. Après cela, l’échantillon entre dans l’aimant RMN.
Pour verrouiller le signal de solvant, tapez la commande de verrouillage et sélectionnez le solvant approprié dans le menu. Utilisez soit le module automatique, atma, soit le module manuel, atmm, pour terminer le processus de réglage et de correspondance. Maintenant, à l’aide de la commande topshim, démarrez le calage automatique, puis exécutez la commande pulsecal pour déterminer l’impulsion de proton à 90 degrés.
Après cela, créez un nouvel ensemble de données et téléchargez la séquence d’impulsions RMN STD. Définissez les fréquences de résonance activées et désactivées pour l’expérience de RMN STD sous l’entrée FQLIST dans la fenêtre ACQUPARS. Réglez la fréquence de résonance désactivée dans une région sans aucun signal de ligand ou de proton protéique.
Ensuite, choisissez une fréquence de résonance dans une région spectrale dépourvue de signaux glycanes. Définissez l’impulsion façonnée à utiliser pendant le temps de saturation dans les paramètres ACQUPARS de la fenêtre ASED. Ensuite, réglez la longueur d’impulsion du proton à 90 degrés, ajustez le temps de saturation total et le délai de relaxation à trois secondes.
Définissez le nombre de balayages sur un multiple de huit et les balayages factices sur huit. Ensuite, définissez le nombre de points dans F2 sur 16K, 32K ou 64K, et un F1 sur deux. Maintenant, à l’aide de la commande automatique rga, réglez le gain du récepteur pour éviter le débordement.
Calculez la durée totale de l’expérience à l’aide de la commande experiment. Enfin, utilisez la commande zg pour envoyer l’expérience pour acquisition. Après l’expérience, effectuez la transformée de Fourier du premier FID et sélectionnez la destination des spectres traités.
Ensuite, à l’aide de la commande lb, ajustez le facteur d’élargissement de ligne. Pour mettre en phase manuellement le spectre, accédez à l’onglet Processus, puis au sous-menu Ajuster la phase. Cliquez et faites glisser sur le bouton correspondant pour effectuer des corrections de zéro et de premier ordre et enregistrer les résultats de la mise en phase.
Après avoir effectué la transformée de Fourier pour la deuxième expérience, enregistrez le spectre traité avec un code différent. Chargez les deux spectres traités avec les fonctions multiples et, à l’aide du bouton de soustraction disponible dans la visualisation multiple, soustrayez-les. Ensuite, ouvrez le spectre de résonance désactivé et exécutez la commande MD pour lancer la fenêtre d’affichage multiple.
Ensuite, téléchargez le spectre STD. Ensuite, effectuez une analyse comparative des fréquences et des intensités des signaux présents dans le spectre RMN STD. Dans l’expérience de résonance désactivée, mesurez les intensités du signal.
Naviguez dans le menu pour sélectionner Processus, puis Intégrer. Définissez soigneusement les régions d’intérêt et enregistrez les intégrales dans un fichier. De même, mesurez les intensités dans l’expérience RMN STD, en vous assurant que des paramètres identiques sont utilisés, et documentez ces intégrales dans un fichier séparé.
Alternativement, les valeurs STD peuvent être déterminées en comparant les intensités du signal entre les spectres STD et hors résonance. Pour calculer la STD relative en pourcentage, attribuez une valeur de 100 % au proton présentant l’intensité STD maximale. Le spectre RMN du proton STD pour l’interaction de la N-acétyllactose amine, avec la galectine humaine 7, a montré des signaux RMN STD indiquant une liaison.
De plus, des signaux appartenant à des protons en contact étroit avec la protéine sont apparus, permettant la délimitation de l’épitope de liaison.
