Pour commencer, ajoutez les composants lentiviraux dans un tube de 15 millilitres et augmentez le volume à 600 microlitres avec un tampon EC. Ajoutez 36 microlitres de solution d’amplification et, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, mélangez à plusieurs reprises, en aspirant et en relâchant une partie du liquide dans la solution. Après cinq minutes, ajoutez 120 microlitres de réactif de transfection et mélangez environ 20 fois, comme démontré précédemment.
Laissez le tube à température ambiante pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite 5,2 millilitres de cDMEM dans le tube. À l’aide d’une pipette de transfert jetable, ajoutez goutte à goutte le mélange de transfection sur la monocouche de cellules HEK293T cultivée dans une fiole T175.
Répartissez le plasmide uniformément grâce à un léger mouvement de balancement latéral du flacon. Incuber la culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Après incubation au microscope fluorescent, confirmer la transfection effective des cellules HEK293T en observant la fluorescence GFP.
Inclinez maintenant le ballon et, à l’aide d’une bande sérologique de 25 millilitres, prélevez le milieu sans perturber la monocouche cellulaire. Transférez le fluide dans un tube de 50 millilitres pré-étiqueté et fermez le couvercle. Ajoutez 25 millilitres de cDMEM chaud le long des parois du ballon sans déranger la monocouche, et remettez le ballon dans l’incubateur.
Après 24 heures, récupérez le milieu, ajoutez la solution de décontamination dans le ballon et placez-le horizontalement pendant les 24 prochaines heures.
