Pour commencer, retirez le piston d’une seringue de 50 millilitres et insérez un filtre stérile en polyéthersulfone à faible liaison protéique ou un filtre stérile en fluorure de polyvinylidène de 0,45 micromètre dans l’extrémité de la seringue. À l’aide d’une bande sérologique de 25 millilitres, ajoutez le lentivirus transfecté HEK293T suspension cellulaire dans la seringue et remettez doucement le piston. Poussez lentement le piston et récupérez le filtrat dans un nouveau tube de 50 millilitres.
Une fois cela fait, retirez le filtre de la seringue et jetez-le dans la solution de décontamination. Ajoutez trois millilitres d’une solution de saccharose à 20 % dans le fond du tube d’ultracentrifugation. Ensuite, réglez le PIPETBOY sur la vitesse la plus basse.
Tenez le tube de l’ultracentrifugeuse à un angle d’environ 45 degrés et ajoutez lentement le milieu filtré contenant du lentivirus sur la paroi du tube. Observez la séparation nette des couches du tube. Si le volume total du tube est inférieur à 29 millilitres, ajoutez du cDMEM frais pour éviter que le tube ne s’effondre pendant l’essorage.
Essuyez le seau de l’ultracentrifugeuse avec de l’alcool à 70 % et placez l’adaptateur de tube au fond du seau. Ensuite, placez le tube d’ultracentrifugation dans le seau. Fermez le seau et placez-le dans le panier.
Pré-refroidissez l’ultracentrifugeuse à quatre degrés Celsius. Placez délicatement le godet dans le rotor et allumez l’aspirateur. Réglez le taux d’accélération et de décélération au réglage le plus bas et centrifugez à 26 000 tr/min pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius.
Après la centrifugation, coupez le vide et retirez délicatement le rotor sans déranger les échantillons. Observez l’ultracentrifugeuse pour confirmer qu’il n’y a pas de déversements et de fuites des seaux. Versez le contenu d’un tube d’ultracentrifugation d’un seul mouvement fluide dans le conteneur à déchets.
Retournez le tube sur un papier de soie double couche pendant 10 minutes. Pendant ce temps, essuyez l’intérieur du seau avec du papier de soie imbibé à 70 % d’éthanol et séchez-le à l’air libre. À l’aide de papier de soie, séchez soigneusement tout liquide restant sur le bord du tube de l’ultracentrifugeuse.
Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu sans sérum approprié et laissez-la pendant 15 minutes. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, mélangez délicatement les préparations de lentivirus et aliquotez-les dans des tubes à vis de 1,5 millilitre. Conservez les préparations lentivirales à moins 80 degrés Celsius.
La préparation réussie du lentivirus a permis d’obtenir un taux d’infection de plus de 95 % avec une dose de cinq microlitres. L’intensité fluorescente moyenne des cellules infectées augmente avec des doses plus élevées. L’injection intrapéritonéale de 100 microlitres de préparation de lentivirus a donné le pourcentage et l’intensité les plus élevés du signal GFP dans les cellules péritonéales de souris.
Des expériences expérimentales avec l’injection de lentivirus de 100 microlitres ont révélé un pourcentage significatif de cellules résidentes exprimant la GFP aux troisième et septième jours, suivies de la disparition de la population infectée au 14e jour.
