Pour commencer, obtenez la région lombaire de l’épine dorsale du petit dans une boîte contenant un milieu de dissection froid. À l’aide d’un stéréomicroscope de dissection et de microciseaux, coupez la colonne vertébrale le long de l’axe sagittal. À l’aide d’une pince à épiler, retirez délicatement la moelle épinière de la cavité dorsale et décollez soigneusement les méninges de la région lombaire isolée de la moelle épinière. Transférez et incubez la région lombaire SC isolée dans un milieu de dissection froid et frais pendant 10 à 15 minutes.
À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, placez le tissu sur le plateau de coupe de l’instrument hachoir perpendiculairement à la lame. Après avoir retiré le produit de dissection résiduel, procédez à la coupe automatisée du SC. À l’aide d’une pipette Pasteur, transférez les tranches et incuberez-les avec un milieu de dissection frais dans une boîte de 35 millimètres pendant 15 minutes. Laver la surface de l’insert de membrane de culture trois fois avec un milieu organotypique, ou MO, et laisser un millilitre de milieu au bas de l’insert de membrane.
Examinez les coupes au microscope stéréoscopique de dissection et ensemencez le nombre souhaité de coupes sur les inserts de membrane conditionnés. Après avoir ajusté l’orientation des tranches et retiré l’excès de milieu, incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, transférez l’insert dans une nouvelle boîte de Pétri et ajoutez un millilitre de MO frais complété par du GDNF au bas de l’insert membranaire.
Incuber les tranches à 37 degrés Celsius. Le premier jour ex vivo, remplacez l’ancien milieu par de l’OM frais. Le troisième jour, passez au milieu de greffe complété par du GDNF et ajoutez du GDNF frais au milieu tous les jours jusqu’au septième jour ex vivo. Pour le reste de la culture à long terme, n’ajoutez GDNF que lorsque le milieu est changé.
L’essai d’immunofluorescence de coupes organotypiques de souris SC en culture à long terme a révélé une large distribution du neurofilament marqueur cytosquelettique et du marqueur neuronal nucléaire RBFOX3, attestant de leur état de santé et de leur identité neuronale.
