Préparation de cellules RSC96 cryoconservées pour la stimulation par champ électrique pulsé nanoseconde

Pour commencer, placez le flacon cryogénique contenant un millilitre de suspension de cellules RSC96 dans un bain-marie à 37 degrés Celsius tout en le secouant rapidement. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger contenant quatre à six millilitres de milieu de culture complet et mélangez bien. Centrifugez le tube à 1 000 G pendant trois à cinq minutes, puis jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans trois millilitres de milieu de culture complet.

Ajoutez maintenant la suspension cellulaire dans un flacon de culture contenant 628 millilitres de milieu de culture complet et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Une fois que la densité cellulaire atteint 80 à 90 %, jetez le milieu de culture et rincez les cellules une à deux fois avec du PBS sans ions calcium et magnésium. Ajoutez ensuite 0,25 % de trypsine et 0,53 millimolaire d’EDTA dans le ballon de culture.

À la fin de l’incubation, observez le détachement cellulaire au microscope. Une fois que la plupart des cellules sont rondes et détachées, remettez rapidement le ballon dans la zone de travail et tapotez-le doucement. Ajouter trois à quatre millilitres de milieu de culture contenant 10% de FBS pour arrêter la digestion.

Ensuite, mélangez soigneusement le contenu de la fiole et aspirez la solution. Centrifuger la suspension cellulaire. Ajoutez 1 000 g pendant cinq minutes.

Après avoir jeté le surnageant, remettre les cellules en suspension dans un à deux millilitres de milieu de culture frais avec un pipetage doux. Transférez la suspension cellulaire dans une nouvelle fiole T25. Ajouter un rapport de un à deux et ajouter sept millilitres de milieu de culture.