Commencez par transfecter les lymphocytes T HEK 293. Trois jours après la transfection, retirez le média des puits et lavez-le une fois avec du PBS. Ajoutez 500 microlitres de trypsine dans chaque puits.
Incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius pour détacher toutes les cellules de la plaque. Ajoutez ensuite 500 microlitres de média DMEM complet dans chaque puits et remettez les cellules en suspension. Transférez toutes les cellules de chaque puits dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre.
Centrifugez ensuite pendant deux minutes à 1 000 g à température ambiante. Retirez délicatement le surnageant par pipetage et lavez une fois la pastille avec un millilitre de PBS. Encore une fois, retirez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de PBS.
Transférez les cellules dans des tubes FACS. Dosez les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux. Chargez la suspension cellulaire non réséquée.
Sur la feuille de travail de cytométrie en flux, appuyez sur Acquérir et ajustez les tensions de diffusion avant et latérale. Pour positionner les cellules dans la région centrale, faites tourner cette population R1 pour exclure les débris dans le quadrant inférieur gauche. Changez la porte de FL1, FL2 dot blot comme G R1. Sélectionnez l’outil de contrôle quadruple et cliquez sur l’extrémité supérieure droite de la population de cellules dans le transfert de points FL1/FL2 en tant que G R1. Ajustez les tensions FL1/FL2 pour positionner les cellules dans le quadrant inférieur gauche.
Appuyez sur pause et sur Abandonner. Chargez ensuite les cellules de contrôle monocolores GFP. Appuyez sur Acquire et ajustez la compensation pour positionner les cellules GFP positives dans le quadrant inférieur droit.
Appuyez sur pause et sur Abandonner. Ensuite, chargez les cellules de contrôle monochromes mCherry. Appuyez sur Acquire et ajustez la compensation pour positionner les cellules positives mCherry dans le quadrant supérieur gauche.
Appuyez sur pause et sur Abandonner. Cliquez sur Acquérir dans la barre de menus et sélectionnez Stockage d’acquisition. Sous Critères de collecte, sélectionnez L’acquisition s’arrêtera lorsque 10 000 événements G1 R1 sont comptés.
Annulez la coche de Configuration. Chargez les cellules d’échantillonnage. Appuyez sur Acquérir et attendez que 10 000 cellules G1 R1 aient été comptées.
Répétez la même chose pour les autres échantillons et commandes.
