Pour commencer, importez tous les fichiers de télécopie dans le tableau de bord d’analyse. Ouvrez l’un des fichiers pour afficher le nuage de points du côté avant. Construisez une porte polygonale pour isoler les cellules intactes, en évitant les débris dans le coin inférieur gauche du graphique.
Étiquetez la sous-population comme cellules intactes et faites glisser cette porte vers la barre de tous les échantillons. Vérifiez le contrôle de chaque échantillon à l’aide du bouton échantillon suivant. Double-cliquez sur la sous-population de cellules intactes de l’échantillon de contrôle négatif pour afficher un nouveau graphique.
Ajustez l’axe du tracé sur FL1-H sur l’axe X pour représenter GFP et FL2-H sur l’axe Y représentant mCherry. Ensuite, sélectionnez l’outil de contrôle quadruple et cliquez sur l’extrémité supérieure droite de la population de cellules négatives. Faites glisser les quatre portes rectangulaires vers la barre de cellules intactes.
Examinez chaque échantillon de commandes monochromes GFP ou mCherry pour vérifier qu’il s’agit d’un contrôle correct à l’aide du bouton d’échantillonnage suivant. Accédez à l’éditeur de mise en page. Ici, sélectionnez des parcelles représentatives et choisissez copier dans l’éditeur de mise en page.
Sélectionnez tous les tracés représentatifs puis double-cliquez pour ouvrir la définition du graphique. Nommez l’étiquette de l’axe X comme GFP et l’étiquette de l’axe Y comme mCherry. Déterminez l’efficacité relative de la réparation de l’ADN en comparant le nombre de cellules positives à la GFP au nombre de cellules positives à mCherry dans la même parcelle.
Une stratégie appropriée d’ajustement de la rémunération et de contrôle a été mise en œuvre pour garantir l’exactitude de l’analyse de la NHEJ et des RH. Cette stratégie a positionné les cellules positives à la GFP dans le quadrant inférieur droit et les cellules positives à mCherry dans le quadrant supérieur gauche. Le pourcentage de cellules GFP positives indiquait l’efficacité de la réparation et de la transfection de l’ADN.
À l’inverse, le pourcentage de cellules mCherry positives ne reflétait que l’efficacité de la transfection. L’efficacité de réparation des DSB de l’ADN a été calculée comme le rapport entre les cellules GFP positives et les cellules mCherry positives. De plus, le rôle de la protéine du syndrome de Wiskott-Aldrich et de la protéine scar Humalog ou WASH dans la réparation de l’ADN a été démontré à l’aide du test NHEJ sur les cellules shCONTROL et shWASH.
La perte de WASH a diminué l’efficacité de la NHEJ, soulignant son rôle dans la promotion de la NHEJ.
