Construction à grande échelle de plasmides UAS-cDNA/ORF par assemblage modulaire basé sur CRISPR (CRISPRmass)

Pour effectuer les réactions parallèles en deux étapes en éprouvette de l’assemblage modulaire basé sur CRISPR ou CRISPRmass, procédez au clivage des squelettes vectoriels identiques des plasmides ADNc/ORF par l’ARNg Cas9 dans la première étape de la réaction en tube à essai. Pour ce faire, disposez des tubes de 0,2 millilitre correctement étiquetés dans un bloc de refroidissement en aluminium sur de la glace. Préparez le mélange maître pour un nombre N de réactions en mélangeant des quantités appropriées de Cas9, d’ARNsg, de tampon Cas9 et d’eau traitée au DEPC.

Une fois que les composants du mélange maître sont additionnés, vortex les mêmes pour assurer un bon mélange. Ensuite, faites tourner le mélange et aliquotez deux microlitres du mélange principal dans chaque tube de 0,2 millilitre. Ensuite, ajoutez 0,4 microlitre de plasmide ADNc/ORF de 0,019 micromolaire dans chaque tube.

Incuber les réactions de clivage à 37 degrés Celsius pendant une heure. Dans la réaction en éprouvette suivante, à la deuxième étape, procédez à l’insertion d’un module UAS spécifique au vecteur dans les plasmides ADNc/ORF linéarisés Cas9 résultants. Pour configurer la réaction en une seule étape de 1,4 microlitre pour chaque échantillon, disposez les tubes de 0,2 millilitre étiquetés dans un bloc de refroidissement en aluminium sur de la glace.

Préparez le mélange principal pour un nombre N de réactions en mélangeant des quantités appropriées de module UAS et de mélange maître d’assemblage de réaction en une seule étape. Tourbillonnez bien le mélange avant de le faire tourner. Ensuite, aliquote 0,77 microlitre du mélange principal dans chaque tube.

Ajoutez 0,7 microlitre de plasmide ADNc/ORF linéarisé Cas9 à l’aliquote de chaque tube et incubez les réactions à 50 degrés Celsius pendant une heure.