Pour commencer, prélevez des échantillons de biopsie de l’œsophage immergés dans un milieu sans sérum de kératinocytes, ou KSFM. Remplacez le KSFM par un millilitre de Dispase I et incubez les biopsies pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres, aspirez la Dispase sans toucher les biopsies ou la pastille de débris cellulaires.
Ensuite, rincez les biopsies avec du DPBS. Après avoir centrifugé les biopsies, utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour aspirer le surnageant. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de trypsine-EDTA aux biopsies et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes en secouant à 800 tr/min.
Ensuite, effectuez un pipetage répété jusqu’à l’obtention d’une suspension unicellulaire. À l’aide de la tête du piston en caoutchouc d’une seringue à tuberculine, filtrez les cellules à travers une crépine de 70 micromètres. Ensuite, lavez la passoire avec deux à quatre millilitres d’inhibiteur de trypsine de soja.
Ensuite, filtrez les cellules à travers une passoire de cellules de 35 micromètres avec un capuchon encliquetable sur un tube de polystyrène à fond rond de cinq millilitres. Après avoir centrifugé la suspension cellulaire, utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour aspirer le surnageant. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans la matrice d’hydrogel de la membrane basale et formez des gouttelettes de 40 microlitres dans une plaque de culture cellulaire en suspension préchauffée.
Ensuite, incubez la plaque sans milieu pendant 20 à 30 minutes à 37 degrés Celsius pour assurer la solidification des gouttelettes d’extrait de la membrane basale. Ajouter du KSFM préchauffé complété par 10 micromolaires de Y27632. Le neuvième jour, la structure multicouche en forme d’oignon dans un noyau kératinisé en croissance au centre de l’organoïde a été observée.
