Pour commencer, fixez un goniomètre à deux axes avec une plaque en titane sur la plaque de platine pour le positionnement XY sous le microscope. Activez le logiciel de numérisation, réglez les pixels sur 512 par 512 bidirectionnels sur on à l’aide d’un objectif 20X. Après avoir effectué l’opération de la fenêtre crânienne, placez le chiot exprimant GCaMP d’un côté de l’hémisphère sur le coussin chauffant.
À l’aide de vis, fixez la barre de titane à la plaque de titane. Ajustez ensuite l’angle de la fenêtre horizontalement à l’aide du goniomètre. Illuminez la surface du cerveau avec le rétroéclairage et sélectionnez la zone d’imagerie à l’aide du positionnement XY avec une lentille d’objectif 5X.
Sous une lentille d’immersion dans l’eau 20X, administrez des gouttes oculaires à la fenêtre crânienne. Après avoir désactivé le rétroéclairage, balayez la surface du cerveau en un mode photonique. Augmentez l’intensité du laser pour visualiser l’autofluorescence verte du verre et de la surface du cerveau.
Couvrez le microscope pour éviter les interférences lumineuses externes. Démarrez le logiciel de numérisation en mode deux photons pour l’imagerie. Calibrez ensuite la puissance laser et le gain du détecteur pour visualiser de manière optimale les signaux GCaMP.
Localisez la profondeur dans une zone d’imagerie peuplée de nombreux neurones exprimant GCaMP et lancez l’imagerie en accéléré pour capturer les signaux GCaMP. La microscopie à deux photons a révélé l’activité des neurones de la couche quatre dans le cortex cylindrique d’un chiot postnatal de sixième jour avec une fluorescence verte. Le GCaMP vert était plus proéminent, ce qui a entraîné une fuite du signal dans le canal rouge et l’identification de 14 régions d’intérêt.
