Pour commencer, isolez et canulez les vaisseaux lymphatiques mésentériques du rat euthanasié. Pressuriser les vaisseaux lymphatiques dans la chambre de profusion et leur permettre de s’équilibrer et de développer des contractions spontanées stables. Ensuite, incubez les vaisseaux lymphatiques avec de l’ester de Fura-2-acétoxyméthyle et de l’acide pluronique pendant 30 minutes dans l’obscurité.
Après l’incubation, videz tout le volume du bain avec un vide à pression négative et remplissez-le trois fois avec la solution saline physiologique sans réactif adaptée à la température. Ensuite, incubez les vaisseaux lymphatiques dans l’obscurité pendant 15 minutes supplémentaires pour éliminer tout indicateur en excès et permettre la désestérification. Transférez la chambre sur un microscope fluorescent inversé avec lumière LED, objectif fluor 20XS, adaptateur d’auto-cadrage et appareil photo pour une capture de fluorescence de 15 hertz.
Connectez le microscope à un ordinateur équipé d’un logiciel d’imagerie pour enregistrer la fluorescence et effectuer la détection des bords. Activez la source lumineuse LED et l’interface du système fluorescent. Lancez maintenant le logiciel IonWizard.
Sous l’onglet Fichier, sélectionnez l’option Nouveau. Accédez ensuite à l’onglet Collecter et sélectionnez Expérimenter. Chargez le modèle expérimental souhaité et cliquez sur OK. Cliquez sur le bouton Démarrer situé en bas de l’écran pour lancer l’expérience.
Ensuite, ajustez les traces à l’écran pour afficher le diamètre du récipient, le numérateur, le signal 340, le dénominateur, le signal 380 et le rapport dans l’ordre décroissant. Pour modifier l’échelle de l’axe Y afin d’améliorer la visualisation des traces, accédez à Traces, assurez-vous que l’option Limites automatiques n’est pas cochée et sélectionnez Modifier les limites utilisateur. Sélectionnez le paramètre à ajuster, entrez les valeurs minimale et maximale de l’axe, puis sélectionnez OK pour confirmer.
À l’aide du logiciel de détection des bords, ajustez l’éclairage de manière à ce que la paroi des vaisseaux lymphatiques apparaisse sous forme de lignes sombres. Sélectionnez une région d’intérêt ou un retour sur investissement exempt de graisse et de débris, et assurez-vous de ne pas déplacer ce retour sur investissement. Réglez le seuil de manière à ce que le bord de la paroi du récipient soit détecté tout au long du cycle de contraction.
Après avoir activé le tube photomultiplicateur, à l’aide d’illuminateurs LED, alternez des longueurs d’onde de 340 et 380 nanomètres et des expositions de 50 millisecondes pour exciter Fura-2. Capturez les spectres d’émission à 510 nanomètres et 15 hertz sur l’ensemble du champ d’imagerie. Pour mesurer le rapport signal sur bruit de fond, il faut d’abord obtenir les fluorescences 340 et 380 avec le vaisseau lymphatique au centre du champ de vision.
Déplacez ensuite le champ de vision vers le bord de la baignoire sans récipient pour capturer l’arrière-plan. Ensuite, remplacez la solution du bain par une solution saline physiologique sans réactif adaptée à la température pour éliminer l’excès d’indicateur Fura-2. Enregistrez le signal fluorescent Fura-2 de base et les contractions spontanées pendant environ 30 minutes.
Enregistrez ensuite la réponse cumulative de la nifédipine et obtenez des mesures de fond pour chaque concentration de médicament. À la fin de chaque expérience, laver les vaisseaux lymphatiques avec une solution saline physiologique sans calcium à température adaptée pour obtenir le signal fluorescent Fura-2 minimum et le diamètre maximal des vaisseaux lymphatiques en l’absence d’ions calcium. Remplacez la solution du bain par une solution saline physiologique à température adaptée contenant 10 ions calcium millimolaires et de l’ionomycine pour obtenir le signal fluorescent Fura-2 maximal et le diamètre minimum des vaisseaux lymphatiques dans des conditions de saturation des ions calcium.
Les paramètres, y compris l’amplitude des pics de calcium, le calcium de base et le pic de calcium, ont montré une réduction dépendante de la concentration avec l’ajout progressif de nifédipine dans la chambre de perfusion. Parallèlement, les paramètres contractiles, tels que la contraction, l’amplitude et le débit calculé, ont également montré une diminution progressive. Les graphiques de Manhattan ont montré les réponses individuelles des vaisseaux lymphatiques pour les mesures de la rythmique, y compris l’intervalle, le temps de contraction et le temps de relaxation.
