Après avoir collecté des faisceaux de gamètes hermaphrodites et des spermatozoïdes d’espèces de coraux gonochriques, placez-les dans des tubes de 50 millilitres étiquetés. Placez quatre microlitres de suspension de spermatozoïdes activés sur une chambre de comptage Makler. Pour évaluer la motilité des spermatozoïdes, ajoutez la concentration de l’échantillon activé.
Ouvrez le fichier de la feuille de données automatique de la biobanque de corail et entrez le facteur de dilution des spermatozoïdes utilisé pour l’évaluation de l’analyse du sperme assistée par ordinateur. Ensuite, entrez les résultats de l’analyse du sperme assistée par ordinateur pour la concentration des spermatozoïdes, la motilité totale et la motilité progressive. Écrivez la concentration de spermatozoïdes sur le tube d’échantillon de sperme filtré et transférez le tube sur le poste de cryoconservation.
Ouvrez la fiche technique automatique de la biobanque de corail partagée et sélectionnez l’onglet Cryoconservation. Après avoir vérifié l’étiquette du tube d’échantillon de sperme, identifiez l’entrée correspondante en vérifiant l’ID de la colonie. À l’aide d’une pipette sérologique, mesurez le volume de l’échantillon de sperme en le prélevant et en l’expulsant dans le même tube. Entrez la valeur dans la colonne E.Vérifiez la colonne 1 calculée automatiquement pour la concentration de cryoprotecteur requise et la colonne H pour le volume de cryodiluant à ajouter.
Démarrez une minuterie. Et à l’aide d’une pipette, ajoutez goutte à goutte le cryodiluant DMSO avec un mélange doux et constant de l’échantillon. Notez l’heure de l’édition du cryodiluant dans la colonne P.Lisez la colonne K pour déterminer le nombre de flacons cryogéniques à remplir.
Débouchez les flacons cryogéniques stériles à code-barres et disposez-les sur une surface stérile. À l’aide d’une pipette sérologique et d’une pipette aliquote, aliquote un millilitre d’échantillons dans des flacons cryogéniques à code-barres et des flacons rebouchons. Placez un flacon de thermocouple et tous les flacons d’échantillon remplis dans un insert de rack cryogénique vide à température ambiante.
Ensuite, placez les flacons cryogéniques factices contenant 10 % de DMSO dans de l’eau de mer filtrée dans des fentes vides sur le support cryogénique. Entrez le numéro de série dans la colonne U de la fiche technique automatique et scannez le numéro de série du rack cryogénique dans la colonne V.Placez le curseur dans la cellule correcte de la colonne Z et scannez le flacon de thermocouple, suivi de tous les tubes de flacon cryogénique. Mettez de côté les racks chargés et scannés pour le reste de l’équilibrage du cryoprotecteur.
Remplissez le récipient de refroidissement du rack cryogénique avec de l’azote liquide au niveau nécessaire pour le refroidissement à environ 20 degrés Celsius par minute. Après la période d’équilibrage du cryoprotecteur de 10 minutes, connectez la sonde du thermocouple à l’enregistreur de données et commencez l’enregistrement. Placez délicatement le rack cryogénique complet dans le récipient de refroidissement et appliquez le couvercle.
Enregistrez l’heure de début dans la colonne Q.Une fois que le flacon de thermocouple indique 80 degrés Celsius ou moins sur l’enregistreur de données, transférez l’insert du rack cryogénique dans un bain d’azote liquide pour tremper les échantillons. Retirez les flacons cryogéniques du rack et transférez-les dans un expéditeur sec pour être transportés à la biobanque. Chez Acropora millepora, les lames de la chambre de glissement de couverture fixe ont montré moins de la moitié du nombre de spermatozoïdes par rapport à la chambre de comptage de Makler.
La validation de la chambre de comptage Makler avec des microbilles de latex disponibles dans le commerce à une concentration connue a permis d’obtenir des comptages cohérents avec une faible variabilité dans la plage attendue. Aucune différence significative n’a été observée dans les concentrations de spermatozoïdes totaux, mobiles ou progressivement mobiles après décongélation dans les échantillons cryoconservés à l’aide de 20 % ou de 30 % de DMSO comme cryodiluant.
