Commencez par disséquer l’hippocampe d’un cerveau de souris embryonnaire et placez le tissu disséqué dans un tampon glacé sans calcium et magnésium ou CMF. Ensuite, retirez le CMF et rincez le mouchoir quatre fois avec du CMF frais et froid, en faisant tourner doucement le tube entre les rinçages. Ajoutez ensuite une solution de trypsine filtrée à 0,125 % et incubez pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius, en remuant toutes les cinq minutes.
Après l’incubation, retirer la solution de trypsine et laver deux fois avec du CMF glacé. Ajoutez ensuite trois millilitres de solution d’inactivation de la trypsine. Ensuite, pour dissocier les cellules, titrez 30 fois en utilisant deux secondes de tirages avec une aiguille de calibre 14 attachée à une seringue de trois millilitres.
Continuez le titrage avec deux secondes tirages 30 fois à l’aide d’une aiguille de calibre 15, puis 20 fois à l’aide d’une aiguille de calibre 16, puis 20 fois avec une aiguille de calibre 18. Ensuite, effectuez 15 fois des tirages de trois secondes à l’aide d’une aiguille de calibre 21 pour terminer la dissociation cellulaire. Vérifiez la présence d’amas cellulaires en plaçant une gouttelette de la suspension cellulaire sur une lame de microscope.
Ensuite, filtrez cinq millilitres de FBS à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micron. Superposez délicatement la suspension cellulaire sur le FBS dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à 200 x g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Retirez le FBS et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu neurobasal chaud sans antibiotiques. Diluer la suspension cellulaire dans 0,4 % de bleu de trypan et obtenir une numération cellulaire. Plaquez les cellules dans 750 microlitres de milieu neurobasal sans antibiotiques dans une lame de chambre à 4 puits préchauffée recouverte de poly-D-lysine.
Incuber les cellules dans une chambre à humidité contrôlée à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.
