Préparez-vous à l’imagerie à l’aide d’un microscope confocal deux jours après la transfection des neurones primaires de l’hippocampe. Réchauffez la chambre de la cellule vivante 60x subjective et l’huile de lentille à 37 degrés Celsius et équilibrez la chambre à 5 % de CO2. À l’aide des oculaires, identifiez les neurones transfectés dans le canal contenant la protéine cargo.
Ensuite, cliquez sur scanner pour imager les neurones et identifier le segment initial axonal du canal SCI-5. Réglez le champ de vision sur une boîte rectangulaire de 32 x 128 pixels et déplacez-le pour imager une région de l’axone, de 50 à 150 microns distale par rapport au segment initial de l’axone. Enregistrez la directionnalité du transport de marchandises et l’orientation du retour d’intérêt, puis appuyez sur Enregistrer sous pour l’enregistrer en tant que fichier.
Notez que les points sur la boîte apparaîtront en haut et à droite dans les images suivantes. Enregistrez le côté de l’image le plus proche du corps cellulaire et le côté le plus proche de l’extrémité axonale pour assurer l’orientation correcte de la polyligne du comagraphe. Réglez la puissance du laser 561 sur 1,40, le sténopé sur 7,8, la taille sur 128 pixels carrés et la vitesse sur 32 images par seconde.
Ajustez le gain pour visualiser le transport de vésicules de fret individuelles sans être masqué par le signal de fond. Sélectionnez Dessiner une ROI rectangulaire dans le menu déroulant ROI et dessinez la ROI de manière à ce qu’elle couvre tout le champ de vision. Ensuite, faites un clic droit et sélectionnez utiliser comme stimulation ROI S1. Ensuite, dans l’onglet de configuration ND, cliquez sur acquérir l’image pour collecter l’image de référence de pré-stimulation.
Réglez ensuite la stimulation sur ROI S1, l’intervalle sur aucun délai, la durée de 1,64 seconde et les boucles sur sept. Cliquez ensuite sur acquérir l’image pour collecter l’image de référence post-stimulation. Sélectionnez Attente, pas d’acquisition, deux minutes pour fournir une période de récupération pour que la cargaison fluorescente repeuple le retour sur investissement blanchi.
Sélectionnez l’intervalle d’acquisition, sans délai, durée cinq minutes, boucles, 8, 615. Cliquez sur le bouton Appliquer les paramètres de stimulation dans l’onglet Configuration ND, puis sur Exécuter maintenant. Collectez également des vidéos de transport d’au moins deux neurones pour analyse.
Réinitialisez le champ de vision à l’ensemble de l’image, puis collectez une image du neurone complet dans les canaux 561 et 647 avec la boîte ROI incluse. Enregistrez les coordonnées XY où l’image a été prise pour la confirmation de l’expression de la protéine après la fixation. L’imagerie de cellules vivantes d’un neurone transfecté exprimant la protéine cargo mAPL’s Synaptophysin a été réalisée à l’aide de ce protocole.
Le domaine externe de la neurofasine dans le segment initial de l’Axone a également été marqué. L’imagerie du transport de marchandises a été réalisée dans la région axonale d’intérêt. D’autres analyses d’immunofluorescence post-imagerie ont confirmé la co-expression de la protéine tau et de la synaptophysine mAPL.
