Méthode à gradient continu pour la purification des îlots de Langerhans porcins

Pour commencer, réglez une pompe sur un débit de 200 millilitres par minute et chargez 125 millilitres de solution à gradient haute densité dans le formateur à gradient continu, puis dans le processeur de cellules. Démarrez la fonction de centrifugation du processeur de cellules à 1 000 tr/min. Libérez l’air du système et représentez-le avec une solution de gradient à haute densité.

Ajoutez ensuite 125 millilitres de solution à gradient à haute densité et 130 millilitres de solution à faible densité au formateur de gradient. Chargez 100 millilitres de suspension de tissu digéré. Augmentez la vitesse du processeur de cellule à 2 000 tr/min pendant trois minutes.

Pour préparer 16 tubes coniques de 50 millilitres pour la collecte de la fraction d’îlot purifiée, ajoutez 25 millilitres de milieu RPMI à chaque tube et disposez-les dans l’ordre croissant. Recueillir les fractions d’îlots de Langerhans purifiées dans les tubes coniques préparés. Pour colorer les îlots, prélever des aliquotes de 100 à 200 microlitres de chaque fraction d’îlot purifiée et évaluer la teneur des îlots à l’aide de la coloration DTZ dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits.

Inspectez chaque fraction à l’aide de la microscopie optique à 4X où les îlots apparaîtront rouge foncé à noir. À l’aide de ce protocole, l’isolement des îlots pancréatiques a été effectué sur trois porcs. Des images en fond clair ont montré des îlots pancréatiques purifiés, dont la viabilité a été caractérisée à l’aide d’une coloration vivante ou morte.

La distribution représentative de la taille des îlots après l’isolement des îlots a montré une distribution de taille d’environ 50 à 100 microns. De plus, le rendement et la pureté ont été évalués à l’aide d’un compteur de cellules d’îlots pancréatiques épiscopaux, indiquant des isolations pancréatiques porcines efficaces.