Pour commencer, compressez la colonne FPLC et préparez la boucle d’échantillonnage pour le chargement de l’échantillon. Allez maintenant dans le logiciel. Double-cliquez sur les paramètres de la pompe et sélectionnez Boucle de charge manuelle.
Connectez maintenant le tube du port de la colonne au tube situé sur le dessus de l’adaptateur de débit. Dévissez le tube de la boucle E et placez-le dans le conteneur à déchets. Ensuite, à l’aide d’une seringue de 30 millilitres, prélevez l’échantillon et fixez la seringue à l’adaptateur de l’orifice d’injection.
Vissez la seringue dans l’orifice d’injection et injectez l’échantillon en vous assurant qu’il est injecté de manière visible dans la boucle d’échantillon. Branchez maintenant l’orifice d’injection avec le capuchon de colonne. Connectez le tube du bas de la boucle d’échantillonnage au port E de la boucle.
Placez ensuite le tube de la pompe B dans le tampon d’élution. Accédez à l’onglet Accueil et sélectionnez Nouvelle méthode. Après cela, sélectionnez l’onglet Paramètres de méthode dans la colonne de gauche.
Allez dans le menu déroulant Type de colonne et sélectionnez Personnalisé. Entrez le volume de la colonne sous forme de cinq millilitres et le débit requis pour le cycle sous forme d’un millilitre par minute. Accédez à la sélection d’unité et sélectionnez CV, volumes de colonne, comme unité de base de méthode.
Vérifiez que l’entrée A est définie sur la mémoire tampon A1 et l’entrée B sur la mémoire tampon B1. Sélectionnez ensuite l’onglet Plan de la méthode dans le menu de gauche. Sous Equilibration, définissez le volume d’équilibrage sur 10 CV.Sous l’onglet Exemple d’application, définissez le volume d’échantillon en observant la boucle d’échantillonnage. Accédez à Lavage de colonne et réglez le volume de lavage sur cinq CV.Pour Elution, réglez le volume de dégradé sur 14 CV, en commençant par 0 % de tampon B à 100 % de tampon B.Enregistrez la méthode et démarrez l’exécution.
Assurez-vous que le collecteur de fractions commence à la position de la première fraction. Entrez le nom de l’exécution et cliquez sur Démarrer. Lors de l’application de l’échantillon, remplacez les tubes actuellement placés dans le conteneur à déchets par un bécher propre.
Collectez les protéines non liées qui s’écoulent de ces tubes au fur et à mesure qu’elles s’écoulent et étiquetez-les comme FT. Une fois l’exécution terminée, accédez à l’onglet Accueil et sélectionnez Ouvrir l’exécution. Ouvrez le cycle pour afficher le chromatogramme. Sélectionnez Intégration des pics dans le menu supérieur pour marquer les pics obtenus.
Sélectionnez l’onglet Fractions pour visualiser les fractions contenant la protéine éluée.
