Pour commencer, récupérez deux tubes de cryoconservation contenant des cellules souches mésenchymateuses dérivées de tissus adipeux humains congelés au passage trois à partir d’azote liquide. Agitez-les dans un bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient complètement décongelés. Désinfectez ensuite les tubes avec de l’alcool à 75 %.
Placez les tubes désinfectés sur une table ultra-propre. À l’aide d’une pipette, aspirez la suspension cellulaire et transférez-la dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Centrifugez le tube dans une centrifugeuse à basse vitesse à 250 G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Pendant ce temps, préparez quatre plats de culture de 10 centimètres et ajoutez neuf millilitres de milieu dans chaque plat. Marquez le nom, le type de cellule, la génération et la date de l’expérience sur chaque plat. Ensuite, préchauffez-les dans un incubateur à cellules thermostatiques à 37 degrés Celsius.
Une fois la centrifugation de cinq minutes terminée, désinfectez le tube de centrifugation avant de le déplacer vers une table ultra-propre. À l’aide d’une pipette, prélever le surnageant et ajouter quatre millilitres de milieu pour obtenir la concentration cellulaire souhaitée. Agitez doucement la solution jusqu’à ce qu’elle soit uniformément dispersée.
Ensuite, ajoutez un millilitre de suspension cellulaire dans chaque plat préchauffé et secouez-le en l’agitant sur une surface plane en croix. Observez les cellules à un grossissement de 40x au microscope optique avant de placer les plats dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. Le deuxième jour, observez l’état cellulaire au microscope optique à un grossissement de 40x avant de procéder à la préparation du milieu d’échange.
Après la désinfection, transférez les boîtes de culture sur une table ultra-propre avec le niveau de biosécurité 2. Retirez le milieu de chaque plat de culture. Rincez doucement le plat avec deux millilitres de solution PBS et ajoutez 10 millilitres de milieu à chaque plat.
Transférez les cellules dans l’incubateur jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la collecte du surnageant.
