Pour commencer, assemblez un microscope de dissection, deux pinces à pointes fines, des ciseaux, une aiguille de seringue d’un millilitre et du papier filtre sur une plate-forme de travail. Ensuite, à l’aide de ciseaux de coude, nucléez les yeux d’une souris anesthésiée. Placez les yeux dans un plat en verre contenant 4 % de paraformaldéhyde et 0,2 % d’acide picrique dans un tampon de phosphate à 0,1 molaire.
Sur le microscope de dissection, à l’aide d’une seringue d’un millilitre, percez un trou au niveau du limbe cornéen et coupez le segment antérieur avec des ciseaux. À l’aide d’une pince, retirez le cristallin de la surface interne de la rétine. Maintenant, à l’aide de deux pinces, pelez soigneusement la sclère jusqu’à ce que la rétine soit complètement isolée de l’œilleton.
Par la suite, coupez la rétine en quatre morceaux. Après une fixation pendant la nuit et une solution de paraformaldéhyde à 4 %, laver les tissus rétiniens dans du PBS à 0,01 molaire six fois pendant 10 minutes chacune. Incuber le tissu rétinien dans du borohydrure de sodium à 1 % dans du PBS à 0,01 molaire pendant 30 minutes.
Encore une fois, lavez les sections rétiniennes dans 0,01 molaire PBS au moins six fois. Ensuite, retirez le vitré avec du papier filtre. Et à l’aide d’une lame de rasoir à double tranchant, coupez la rétine en petites sections entre 100 et 300 micromètres.
Lavez les bandes rétiniennes dans du PBS 0,01 molaire six fois pendant 10 minutes chacune avant de les incuber avec le réactif A et le réactif B du kit ABC pendant deux jours. Ensuite, lavez les bandes rétiniennes dans un tampon tris de 0,05 molaire trois fois pendant 10 minutes chacune. Pré-incubez les bandes rétiniennes avec 5 % de réactif 1 et 5 % de réactif 3 du diaminobenzène, ou kit DAB, dans de l’eau distillée pendant une heure à température ambiante.
Pour colorer les bandes rétiniennes avec du DAB, ajoutez le même volume de solution provenant de trois tubes du kit DAB dans l’ordre. Au microscope de dissection, observez l’état de coloration. Lavez les bandelettes rétiniennes avec un tampon tris de 0,05 molaire trois fois pendant 10 minutes chacune.
Enfin, lavez les bandes dans du PBS 0,01 molaire six fois pendant 10 minutes chacune. Dans les expériences de contrôle, les pédicules coniques avec deux rubans et les bâtonnets sphériques avec un ruban n’ont montré aucune immunoréactivité en l’absence d’anticorps primaires. La protéine kinase C alpha a identifié les cellules bipolaires en bâtonnet dans la rétine.
Le support DAB met en évidence la présence de la protéine kinase C alpha et des dendrites cellulaires bipolaires, formant des synapses avec des terminaisons de bâtonnets et de cônes dans la couche plexiforme externe. De plus, le produit de réaction DAB aide à identifier les terminaisons des cellules bipolaires des bâtonnets et les processus axonaux dans la couche plexiforme interne. Il a été démontré que les cellules amacrines d’immunoréactivité de la substance P sont présynaptiques aux cellules amacrines négatives de la substance P.
De plus, les cellules amacrines d’immunoréactivité de la substance P étaient post-synaptiques aux terminaisons bipolaires dans les niveaux de la sous-couche trois et de la sous-couche cinq de la couche plexiforme interne, respectivement.
