Pour commencer, placez une passoire de 70 micromètres sur un tube en polypropylène de cinq millilitres. Pipette 500 microlitres de milieu de cellules neurales dessus. Transférez l’homogénat de tissu d’hippocampe de souris dissocié dans le tube à travers la passoire.
Ensuite, pipetez deux fois un millilitre de milieu de cellules neurales froides sur l’homogénéisateur pour le rincer. Maintenant, ajoutez 500 microlitres de DPBS glacé à la pastille pour la remettre en suspension. Augmentez le volume de la suspension à 1,5 millilitre avec DPBS.
Pipette de 500 microlitres de solution isotonique de colle sur l’échantillon. Recouvrir la solution de deux millilitres de DPBS froid dans une centrifugeuse. Aspirez ensuite la couche supérieure et le disque de myéline dans la phase intermédiaire.
Ensuite, ajoutez quatre millilitres de DPBS froid dans le tube, aspirez le surnageant après l’avoir centrifugé. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de solution de coloration de viabilité fixable. Pipetez un millilitre de DPBS froid sur l’échantillon avant de centrifuger l’échantillon à 300 x g pendant cinq minutes.
Après avoir aspiré le surnageant, ajoutez 100 microlitres de solution de coloration CD16, CD32. Faites tourbillonner l’échantillon pendant cinq secondes, puis incuberez. Après l’incubation, ajoutez un millilitre de tampon FACS dans l’échantillon et centrifugez.
Pipette 100 microlitres du mélange de coloration dans le tube. Ensuite, incubez les échantillons pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Maintenant, ajoutez un millilitre de tampon FACS à l’échantillon avant de centrifuger comme précédemment.
Remettre le granulé en suspension dans 250 microlitres de tampon de fixation après avoir jeté le surnageant. Ensuite, ajoutez deux millilitres de tampon de perméabilisation dans le tube et centrifugez à nouveau. Pipette 100 microlitres de solution de coloration vGLUT1 sur la pastille.
Ensuite, faites tourbillonner le mélange pendant environ cinq secondes avant l’incubation et la centrifugation. Remettre en suspension la pastille de cellule dans 250 microlitres de tampon FACS. Enfin, filtrez les échantillons à travers un filtre de 40 micromètres.
Un signal fluorescent vGLUT1-PE plus élevé a été observé à partir de la microglie de l’hippocampe par rapport au contrôle isotype. Un signal fluorescent vGLUT1-PE plus élevé a été trouvé dans la microglie du bulbe olfactif et un signal plus faible dans le cervelet par rapport à l’hippocampe. L’intensité du signal la plus faible a été détectée dans les macrophages de la rate.
