Pour commencer, incubez un tube contenant du tissu d’hippocampe de souris dissocié dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Transférez la suspension de cellules troubles dans un nouveau tube à centrifuger de 15 millilitres. Après avoir jeté le surnageant, remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de la solution de mélange de lavage.
Ensuite, passez l’échantillon à travers un filtre de 70 micromètres dans un tube de microcentrifugation de cinq millilitres avant de centrifuger à nouveau. Soumettez l’échantillon à la centrifugation à gradient de Percoll, puis remettez en suspension la pastille cellulaire dans 100 microlitres de tampon de coloration MACS et incuber. Maintenant, pipetez un millilitre de tampon MACS sur l’échantillon avant de le centrifuger.
Ensuite, suspendez la pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon MACS. Ensuite, rincez les colonnes de sélection positive d’un séparateur magnétique avec trois millilitres de tampon MACS. Appliquez délicatement 500 microlitres de suspension cellulaire sur une colonne.
Après avoir lavé les colonnes trois fois avec un tampon MACS, placez les colonnes sur des tubes coniques de 15 millilitres. Ajoutez cinq millilitres de tampon MACS sur la colonne. Ensuite, centrifugez les échantillons à 300 g pendant 10 minutes, puis ajoutez un millilitre de DMEM préchauffé à la pastille.
Transférez 500 microlitres de la suspension finale de la cellule dans les puits d’une plaque à 24 puits. Remplacez 250 microlitres de chaque puits par du DMEM frais préchauffé. Ensuite, ajoutez trois microgrammes de synaptosomes marqués en rouge pHrodo sur le milieu.
Ajoutez le même volume de synaptosomes non marqués aux témoins négatifs. Après l’incubation, lavez les puits avec du DPBS froid. Maintenant, pipetez 200 microlitres de trypsine-EDTA dans chaque puits.
Après une incubation de 35 secondes, pipetez un millilitre de DPBS contenant du FBS dans chaque puits. Transférez la suspension cellulaire dans un tube en polypropylène de cinq millilitres à travers une passoire, puis lavez chaque puits deux fois avec 500 microlitres de DPBS glacé. La centrifugeuse a prélevé des échantillons à 500 g pendant cinq minutes.
Ensuite, incubez les cellules dans 100 microlitres de la solution de coloration pendant 10 minutes sur de la glace. Ensuite, ajoutez CD11b et CD45 à la solution de coloration pour obtenir une concentration finale de 1 à 100. Incuber les échantillons à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes dans l’obscurité.
Pipetez un millilitre de tampon FACS dans l’échantillon, puis soumettez-le à une centrifugation finale à 300 g pendant 10 minutes avant l’analyse cytométrique en flux. Une fluorescence PE positive comparable à celle obtenue à partir de synaptosomes à pH 4 a été observée dans les microglies CD11b positives et CD45 positives.
