Pour commencer, retirez du congélateur le cryoflacon contenant les cellules CD34+ du sang de cordon. Décongelez les cellules dans un bain-marie avant de les transférer dans un tube de 50 millilitres. Tout en secouant le tube dans le sens de la goutte, ajoutez 10 fois le volume des cellules d’IMDM préchauffé contenant 50 % FBS et 0,1 milligramme par millilitre de DNase dans le tube.
Centrifuger la suspension cellulaire à 500 G pendant cinq minutes. Remettre la pastille en suspension dans 20 à 40 microlitres de PBS contenant de la pénicilline et de la streptomycine. Conservez les cellules sur de la glace jusqu’à utilisation.
Préparez une seringue de trois millilitres avec une aiguille d’un demi-pouce de calibre 27. Préparez une seringue à insuline de 0,5 millilitre avec une aiguille de calibre 29 de 12,7 millimètres contenant une suspension de cellules CD34+. Ensuite, préparez une seringue à insuline d’un millilitre avec une aiguille de calibre 29 de 0,5 pouce avec 100 microlitres de buprénorphine.
Transférez la souris anesthésiée dans un cône nasal et effectuez un pincement des orteils pour confirmer qu’elle est prête pour l’injection. Posez la souris sur le dos et fléchissez ses pattes arrière. Pour sécuriser les pattes arrière, placez le pouce de la main non dominante sur le pied, le majeur sur la hanche et l’index à l’extérieur du fémur.
Épilez doucement les poils autour de la rotule et essuyez la zone avec un tampon imbibé d’alcool. Maintenant, à l’aide d’une seringue de trois millilitres avec une aiguille d’un demi-pouce de calibre 27, percez doucement un trou à travers la peau vers le fémur. Une fois que l’aiguille est dans l’os, tournez-la dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que toute l’aiguille soit dans l’os.
Retirez l’aiguille en effectuant une rotation dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à mi-chemin. Essuyez l’aiguille avec un tampon imbibé d’alcool et continuez à tourner l’aiguille dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour un retrait complet. Ensuite, insérez la seringue d’insuline de 0,5 millilitre contenant la suspension cellulaire dans la tige fémorale.
Une fois l’aiguille dans l’os, relâchez la prise sur la jambe et injectez doucement 25 microlitres de suspension dans le fémur. Enfin, injectez la buprénorphine par voie sous-cutanée et retournez la souris dans sa cage d’origine, ce qui lui permet de se remettre de l’anesthésie.
