Pour commencer, nettoyez soigneusement toutes les zones de l’incubateur et de la pompe péristaltique avec un désinfectant pour assurer un environnement quasi stérile. Ensuite, rincez chaque tube avec 700 microlitres de PBS avec du magnésium et du calcium, suivis de 500 microlitres de C2 ou de milieu conditionné EC. Utilisez le tube avec la courte distance entre le verrou du leurre et le bouchon de pompe péristaltique pour la cavité gauche et le tube avec l’autre symétrie pour la cavité droite.
Après avoir récupéré la biopuce avec les cellules HUVEC et C2BBe1 de l’incubateur, effectuez un échange de milieu avec 350 microlitres pour chaque chambre. Déplacez ensuite les bouchons du site inférieur vers le site supérieur. Ajoutez 350 microlitres de milieu frais dans la chambre inférieure de la biopuce.
Après cela, retirez toutes les prises et remplissez tous les ports jusqu’en haut. En commençant par la cavité gauche, insérez l’adaptateur de verrouillage de leurre dans le port de la biopuce pour connecter le premier tube au port droit de la chambre supérieure. Connectez ensuite le deuxième tube à l’orifice gauche de la chambre inférieure.
Ensuite, prenez un réservoir et ajoutez une petite goutte de milieu de culture cellulaire au fond du réservoir. Insérez ensuite le réservoir du côté opposé du premier tube et répétez l’opération pour l’autre chambre. Une fois que tous les orifices sont connectés à un tube ou à un réservoir, remplissez les réservoirs avec 3,5 millilitres de milieu de culture cellulaire.
Placez ensuite le côté libre du tube, auquel est fixé le couvercle, sur le dessus du réservoir pour fermer le système microfluidique de chaque chambre. Transportez la biopuce vers la pompe péristaltique. À l’aide des bouchons de pompe péristaltique, connectez chaque tube à la pompe péristaltique de sorte que le fluide s’écoule du réservoir dans la cavité et revient via la pompe.
Perfuser ensuite chaque chambre avec un débit de 50 microlitres par minute. Une fois la pré-profusion terminée, arrêtez la pompe péristaltique. Retirez le couvercle relié au tube de chaque réservoir et placez-le sur un tissu stérile à côté de la pompe.
Après avoir retiré tout le fluide, remplissez les réservoirs avec 2 millilitres de milieu fraîchement préparé. Rebranchez la tubulure et le couvercle et poursuivez la perfusion circulaire à un débit de 50 microlitres par minute pendant 24 heures supplémentaires. Une fois la pompe péristaltique arrêtée, ouvrez les réservoirs de toutes les cavités.
Videz les réservoirs et débranchez les tubes et les réservoirs de la biopuce. Lavez les cavités microfluidiques avec 500 microlitres de PBS froid avec du magnésium et du calcium deux fois par chambre. Ajoutez 500 microlitres de méthanol glacé dans toutes les cavités.
Après avoir ouvert la puce, coupez ou retirez la feuille de liaison de la biopuce. Coupez le tissu contenant la membrane PET en deux pour le colorer en parallèle avec différents panneaux immunitaires. À l’aide d’une pince à épiler de précision, transférez chaque morceau de membrane dans un puits séparé dans une plaque de 24 puits avec une solution de blocage et de perméabilisation.
Transférez ensuite les morceaux de membrane sur une lame de verre propre à l’intérieur d’une chambre humide. Ajoutez 50 microlitres d’anticorps primaires préparés et de solution de coloration à chaque morceau de membrane. Une fois les échantillons transférés dans une plaque à 24 puits, laver les membranes deux fois pendant 5 minutes avec une solution de lavage, puis avec du PBS contenant du magnésium et du calcium.
À l’aide d’un support de montage à fluorescence et d’un verre de protection, montez les morceaux de membrane sur une lame de verre propre et stockez-les à 4 degrés Celsius jusqu’à l’imagerie microscopique. Après cinq jours de profusion, l’ADN nucléaire coloré au DAPI a montré que les macrophages dérivés des monocytes exprimant CD68 se propageaient entièrement dans le tissu vasculaire. Les HUVECs ont créé une couche confluente montrant l’intégrité des tissus par la formation de jonctions d’adhérence, telles que la VE-cadhérine.
De plus, le facteur von Willebrand est fortement exprimé par les HUVEC. Après cinq jours de profusion, les cellules C2BBe1 ont formé des couches de cellules épithéliales polarisées exprimant les protéines de jonction E-cadhérine et ZO-1. La croissance tridimensionnelle des structures villeuses et cryptiques de l’épithélium peut être détectée dans les sections x et y de la pile Z après six jours de perfusion.
