Isolement de fractions mitochondriales enrichies à partir de cultures cellulaires et de petits échantillons de tissus animaux pour des tests d’activité sur gel

Pour commencer, mettez en suspension la pastille de cellule emballée dans un volume de tampon hypotonique égal à sept fois le volume de la pastille de cellule. Transférez la suspension cellulaire dans un homogénéisateur Potter-Dounce et incubez sur de la glace pendant deux minutes, laissant les cellules gonfler. Brisez les membranes cellulaires en effectuant 8 à 10 passages dans l’homogénéisateur couplé à un pilon en téflon motorisé tournant à 600 tr/min.

Ajoutez un volume égal de tampon hypertonique à la suspension cellulaire pour générer un environnement isotonique. Transférez l’homogénat dans un tube de 10 à 15 millilitres. Centrifugez à 1 000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et recueillez le surnageant dans un tube en polypropylène de 1,5 millilitre.

Pour recueillir la fraction brute mitochondriale, centrifugez dans un microfuge à 16 000 G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille enrichie en mitochondries avec 0,5 millilitre de tampon A.Combinez le contenu de deux tubes en un seul et centrifugez comme démontré précédemment. Après la dernière centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 300 microlitres de tampon A.Quantifier la concentration en protéines mitochondriales à l’aide du test Bradford.

À l’aide de ciseaux, coupez les 20 à 30 milligrammes de tissu animal. Lavez le mouchoir trois à quatre fois dans un tampon d’homogénéisation à l’aide d’une passoire, en prenant soin de ne pas perdre les petits morceaux. Transférez les morceaux de tissu avec le tampon dans l’homogénéisateur.

Pour le foie, la rate et les reins, effectuez quatre à six mouvements de haut en bas dans le LVM Potter avec un pilon en téflon motorisé à 600 tr/min.