Analyse des supercomplexes mitochondriaux dans les fractions de tissus de mammifères au moyen de dosages d’activité en gel

Commencez par remettre en suspension les fractions mitochondriales obtenues à partir de cultures de cellules de mammifères ou de tissus dans un tampon d’échantillon natif bleu pour obtenir une concentration protéique d’environ 10 milligrammes par millilitre. Pour solubiliser les membranes mitochondriales, ajoutez de la digitonine pour obtenir un rapport de quatre grammes de digitonine par gramme de protéine mitochondriale. Mélanger par pipetage doux et incuber sur glace pendant cinq minutes.

Centrifuger la suspension dans un microfuge à 20 000 G pendant 25 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les matières insolubles. Prélever le surnageant dans un tube frais, puis ajouter 5 % de bleu Coomassie G-250, soit l’équivalent d’un tiers du volume initial de remise en suspension, et mélanger par pipetage. Ajouter un tampon de cathode froide A dans la chambre supérieure de l’appareil d’électrophorèse et un tampon d’anode dans la chambre inférieure.

Chargez 30 à 100 microgrammes de protéines mitochondriales dans les puits sur un gel de polyacrylamide. Après l’électrophorèse, placez le gel dans une boîte en plastique. Ajoutez un volume suffisant de solution de dosage de l’activité du gel appropriée pour couvrir le gel et incubez à température ambiante en secouant doucement, à l’abri de la lumière.

Lorsque les bandes appropriées se sont développées, retirer la solution d’essai. Lavez le gel deux fois avec de l’eau distillée avant de le fixer avec 40% de méthanol et 10% d’acide acétique pendant 30 minutes. L’analyse de l’activité du gel a révélé des modèles d’assemblage distincts de super-complexes chez les souris et les cellules humaines.

Le complexe libre 1 a été observé dans les cellules de souris, alors qu’il n’était pas détectable dans les mitochondries humaines. Les motifs du complexe 4 étaient similaires dans les lignées cellulaires humaines, mais variaient dans les lignées cellulaires de souris en raison d’une variante mutante de SCAF1.