Pour commencer, décongelez la thrombine et l’aprotinine sur de la glace et placez un flacon de fibrinogène dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. À l’aide d’une pipette, homogénéisez-les sous le capot. Ensuite, à l’aide d’une pince stérile, placez les inserts dans les puits de culture, en laissant au moins une colonne ou une rangée vide sur la plaque.
Dans un tube de 0,25 millilitre, ajoutez d’abord les volumes requis de fibrinogène et d’aprotinine. Ensuite, ajoutez la thrombine dans le tube et rincez rapidement deux fois sans créer de bulles. Dessinez tout le contenu du tube.
Positionnez la pipette verticalement au-dessus du centre de l’insert et rincez doucement un mélange de réactifs sans générer de bulles. Incuber pendant au moins une heure à 37 degrés Celsius pour solidifier jusqu’à ce que le mélange devienne blanc opaque. Pour l’ensemencement d’organoïdes, confirmer au microscope que les micro-masses forment des masses cellulaires sphériques, avec un chœur compact entouré d’un halo de plus faible densité de progéniteurs thymiques précoces.
Coupez l’extrémité d’un cône P200 et lavez-le avec une solution anti-adhérente. Inclinez la plaque à une position presque verticale et aspirez les masses cellulaires par le fond du puits. Déposez délicatement la masse au sommet des hydrogels sans toucher le gel.
Vérifiez au microscope qu’il ne reste aucun organoïde dans les puits de la plaque. Ajoutez ensuite lentement un quart du volume du milieu de culture en haut de l’hydrogel sans le toucher, et ajoutez les 3/4 restants au fond du puits. Ajoutez un millilitre de PBS dans les puits de culture vides pour maintenir l’humidité dans la plaque et incubez à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Les organoïdes forment des structures sphériques à oblongues et fusionnent parfois pour former des structures plus grandes dans les hydrogels.
