Pour commencer, procurez-vous une souris SMARTA CD 45.1 positive âgée de six à huit semaines et injectez-lui 200 microgrammes de peptide LCMV GP 61-77 dans 100 microlitres de milieu RPMI par voie intraveineuse. Après avoir acquis les splénocytes de la souris, suspendez-les dans 2% RPMI pour obtenir une densité cellulaire de un fois 10 aux cellules T supérieures par millilitre et placez le tube avec les cellules sur de la glace. Distribuez 50 microlitres de suspension cellulaire avec 150 microlitres de tampon de coloration dans chaque puits d’une plaque à fond rond de 96 puits.
Centrifugez la plaque à 96 puits à 800 G pendant une minute à quatre degrés Celsius et décantez soigneusement le surnageant. Vortex la plaque et ajoutez 200 microlitres de tampon de coloration dans chaque puits. Après avoir granulé les cellules, mettez-les en suspension et incubez-les avec un cocktail d’anticorps de surface sur de la glace pendant 30 minutes dans l’obscurité.
Après deux lavages, mettez les cellules en suspension dans 200 microlitres de tampon de coloration et transférez-les dans un tube de cytométrie en flux. Effectuez une analyse par cytométrie en flux pour vérifier l’état d’activation des lymphocytes T positifs SMARTA CD4. Ensuite, ensemencez une fois 10 les six lymphocytes T CD4 positifs SMARTA par puits dans une plaque de 24 puits.
Faites tourner les cellules à 800 G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius et retirez délicatement le milieu surnageant. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu rétroviral et huit microgrammes de polybrène dans chaque puits. Le spin transduit les cellules à 800 G pendant deux heures à 37 degrés Celsius.
Après avoir jeté le milieu rétroviral, incubez les cellules avec un millilitre de 10% RPMI préchauffé complété par de l’interleukine 2. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez-la. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension les cellules avec 2 % de RPMI pour obtenir une densité cellulaire de un fois 10 à la huitième cellule par millilitre.
Pour évaluer l’efficacité de la transduction, aliquote 50 microlitres de suspension cellulaire dans une plaque à fond rond de 96 puits. Incuber-les sur de la glace avec le cocktail d’anticorps de surface, y compris CD4, V alpha deux et l’anticorps associé à l’étiquette vectorielle. Lavez les cellules et effectuez la cytométrie en flux comme démontré précédemment.
Ensuite, injectez une fois 10 des six lymphocytes T positifs de CD 45.1 SMARTA CD4 positifs à une souris receveuse C57BL/6 par voie intraveineuse, puis une fois 10 aux six unités formant des plaques de LCMV Armstrong le lendemain. Après avoir acquis les splénocytes de la souris, colorez-les pour vérifier les marqueurs souhaités. Pour détecter les facteurs transcriptionnels, incubez les cellules avec 200 microlitres de paraformaldéhyde à 2 % à température ambiante pendant 20 minutes dans l’obscurité.
Enfin, effectuez une cytométrie en flux pour détecter les facteurs au stade précoce de l’infection aiguë par le LCMV. Le troisième jour après l’infection, une bifurcation équilibrée des lymphocytes T auxiliaires folliculaires et des lymphocytes T auxiliaires 1 entre les lymphocytes T CD4 positifs de MIGR1 SMARTA a été observée. Une différenciation dirigée par les lymphocytes T auxiliaires folliculaires prédominants et des niveaux d’expression accrus de BCL6 ont été observés dans les lymphocytes T positifs MIGR1, BCL6 SMARTA CD4.
