Pour commencer, procurez-vous un organoïde tumoral dérivé du patient ou PDTO et ajoutez trois millilitres de milieu de culture DMEM F/12 fraîchement enrichi au PDTO tous les trois à quatre jours. À l’aide de l’irradiateur de la plate-forme de recherche sur les rayonnements pour petits animaux, irradiez les dômes contenant le PDTO en mode champ ouvert. Immédiatement après l’irradiation, laver chaque PDTO contenant un dôme Nagrigel avec deux millilitres de milieu DMEM F/12 enrichi.
Ensuite, à l’aide d’un P 1000, remettre en suspension le PDTO dans un à trois millilitres d’une enzyme recombinante obtenue dans le commerce. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Centrifugez le tube pour granuler les cellules et aspirez le surnageant pour laisser environ un millilitre d’enzyme recombinante dans le tube.
Ensuite, lavez les cellules avec un milieu DMEM F/12 enrichi et filtrez la suspension cellulaire dans un filtre à mailles de 40 micromètres pour éliminer les grappes de cellules, colorez un petit échantillon des cellules filtrées avec 10 % de bleu de tripine dans du PBS et comptez-les dans un compteur de cellules automatisé. Remettre les cellules en suspension pour obtenir une densité de 800 cellules dans 50 microlitres de milieu enrichi avec 66% de magrigel. Plaque suivante, chaque dôme dans des puits séparés d’une plaque de culture de 48 puits compatible avec l’imagerie et incubez la plaque pour laisser le magrigel se solidifier.
Enfin, ajoutez 0,5 à un millilitre de milieu DMEM F/12 enrichi dans chaque puits pour l’imagerie en direct.
