Pour observer la localisation subcellulaire de la GFP, après 48 heures d’agro-infiltration de Nicotiana benthamiana, sélectionnez une feuille plate et faites un trou de six millimètres à l’aide d’une perforatrice. Versez une solution de saccharose à 30 % sur une lame de verre. Placez l’échantillon de feuille avec le dos vers le haut et couvrez-le d’un verre de protection.
Prélever les feuilles fraîches et intactes de N. benthamiana exprimant la GFP recombinante trois jours après l’agro-infiltration, et peser les feuilles. Rincez le limbe des feuilles avec de l’eau pré-refroidie, stérilisée et doublement distillée pour éliminer les débris. Immergez 20 grammes avec le côté abaxial vers le bas dans 500 millilitres de tampon phosphate pré-refroidi de 100 millimolaires dans un bécher à large ouverture de 1 000 millilitres.
Couvrez les feuilles avec du nylon à mailles 100, du fil à mailles fines et une assiette en plastique. Connectez le bécher à une pompe à vide. Appliquez un vide de 0,8 mégapascal pendant une minute, puis rétablissez rapidement la pression atmosphérique.
Retirez les feuilles du tampon et séchez-les doucement avec du papier absorbant. Enroulez les feuilles et enveloppez-les avec du fil à mailles. Pour recueillir le liquide de lavage apoplastique, ou AWF, placez les feuilles roulées côté vers le haut dans des tubes à centrifuger de 50 millilitres avec du fil de maille fixé par les capuchons des tubes.
Centrifugez les feuilles à 500g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez les feuilles et prélevez l’AWF à l’aide d’une pipette. Ajouter la résine Nickel Sepharose excel dans un tube dans un rapport de un à 1 000 par rapport au volume de l’extrait de protéines.
Lavez la résine de nickel trois fois avec 10 fois le volume de résine de l’eau bidistillée et le tampon phosphate séparément, à tour de rôle. Incuber l’extrait de protéine avec de la résine de nickel pendant deux heures pour permettre une liaison complète. Ensuite, centrifugez à 500 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les protéines non liées dans le surnageant.
Lavez trois fois avec 20 fois le volume de résine du tampon phosphate. Après le dernier lavage, ajoutez 10 fois le volume de résine de 250 millimolaires d’imidazole pour éluer les GFP. Centrifugez le mélange à 500 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et récupérez le surnageant.
L’analyse par transfert Western a confirmé l’expression transitoire des GFP de la protéine recombinante de 30 kilodaltons chez N. benthamiana. La microscopie à fluorescence a mis en évidence la présence de GFP au sein de l’apoplaste. Les protéines AWF extraites par centrifugation par infiltration sous vide contenaient également des GFP.
Sur les huit solutions d’extraction testées, le tampon phosphate a extrait la plus grande quantité d’AWF et de GFP. La comparaison du tampon phosphate à pH variable a révélé une amélioration de l’extraction de l’AWF et des GFP dans des conditions neutres à légèrement alcalines. De plus, un tampon de phosphate de 100 millimolaires a montré une efficacité maximale pour la récupération des FAE et des GFP.
Avec un tampon de phosphate de 100 millimolaires, 495 microgrammes de protéines AWF totales par gramme de feuille fraîche ont été récupérés de l’apoplaste. L’AWF extrait contenait 10 microgrammes de GFP, ce qui correspondait à environ 18 % des GFP dans la protéine soluble totale. Après la chromatographie d’affinité au nickel, la pureté des GFP a atteint 84,3 % lors de l’extraction par AWF, ce qui est nettement supérieur à la pureté de 44,9 % obtenue lors de l’extraction des protéines solubles totales.
