Pour commencer la culture cinq fois 10 à la cinquième cellule DF-1 par puits dans une plaque à six puits avec du DMEM complété par 10% de FBS. Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluence, jetez le sérum contenant le milieu de culture cellulaire. Après avoir lavé les cellules trois fois avec du PBS, ajoutez deux millilitres de milieu de culture cellulaire sans sérum, suivis d’une solution de virus IBDV dans chaque puits.
Après une heure d’absorption du virus, lavez les cellules avec du PBS trois fois et incubez-les pendant 24 heures avec deux millilitres de DMEM complétés par 2% de FBS. Ajoutez 500 microlitres de trypsine par puits, suivis de deux millilitres de DMEM avec 10% FBS après une minute. Centrifugez les cellules et retirez le surnageant avec précaution.
Après avoir remis en suspension la pastille cellulaire dans le PBS, agitez doucement le tube pendant trois secondes et centrifugez les cellules comme décrit précédemment. À l’aide d’un hémocytomètre sous microscope, comptez les cellules pour les remettre en suspension dans un volume approprié de tampon de coloration par cytométrie en flux et vortex la suspension. Ajoutez 100 microlitres de suspension à cellule unique dans un tube en polystyrène à fond rond de cinq millilitres.
Incuber les cellules infectées par l’IBDV et simuler les cellules témoins avec un microgramme d’anticorps appropriés sur de la glace pendant 30 minutes dans l’obscurité. Agiter doucement le tube tourbillonnaire toutes les 10 minutes. Lavez les cellules avec un millilitre de tampon de coloration par cytométrie en flux et centrifugez le tube.
Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 100 microlitres de tampon de coloration par cytométrie en flux. Ensuite, incubez les cellules avec 10 microgrammes par millilitre d’iodure de propidium pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Et ajoutez 400 microlitres de tampon de coloration par cytométrie en flux pour le test de cytométrie en flux.
Effectuez une cytométrie en flux avec le tube de contrôle à blanc suivi des tubes colorés simples pour ajuster les paramètres de tension et de compensation avant d’analyser tous les échantillons. La cytométrie en flux a indiqué qu’un nombre considérable de cellules étaient positives pour les fragments N-terminaux de Gasdermin E de poulet après une infection par IBV, tandis que les fragments C-terminaux de Gasdermin E de poulet clivé étaient à peine détectables par cytométrie en flux à l’aide de la coloration de l’antigène de surface membranaire. La population de fragments N-terminaux de gasdermine E de poulet et de cellules doublement positives à l’iodure de propidium dans les cellules infectées par le VCI était significativement supérieure à celle des témoins infectés par le virus de l’IBD, ce qui suggère que cette partie des cellules infectées par le virus de l’IBDV subissait une pyroptose.
