Commencez par dissocier le tissu. À l’aide de deux paires de pinces, vous pourrez retirer le tissu adipeux du tissu mammaire. Assurez-vous que le tissu mammaire restant pèse environ un gramme.
Rincez le tissu mammaire dans cinq millilitres de solution d’éthanol à 75 % pendant cinq secondes. Ensuite, lavez avec 20 millilitres de solution de lavage deux fois pendant cinq minutes chacune. Ensuite, à l’aide de deux lames chirurgicales, coupez le tissu mammaire en fragments plus petits.
En continu pendant 15 minutes pour obtenir un homogénat de tissu, transférez le tissu déchiqueté dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Ajoutez 10 millilitres de solution de dispase et de collagénase, trois millilitres de trypsine à 0,25 % et sept millilitres de PBS pour un total de 20 millilitres de solution de digestion. Placez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et incubez pendant 1 heure et demie, en secouant le tube toutes les 20 minutes.
Pour arrêter le processus de digestion, ajoutez 20 millilitres de solution neutralisante. Ensuite, pipetez le contenu environ 15 fois pour assurer un mélange complet. Filtrez le mélange à travers un filtre à mailles de 100 microns.
Après cela, centrifugez à 156G pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le surnageant. Répétez l’incubation de la pastille avec 20 millilitres de solution neutralisante, puis mélangez par pipetage.
Centrifugez à nouveau pendant cinq minutes. Retirez délicatement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 10 millilitres de milieu de culture initial. Plaquez la suspension cellulaire dans une boîte de culture cellulaire de 100 millimètres.
Cultivez les cellules dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Remplacer le milieu de culture d’origine par un milieu de cellules épithéliales frais tous les trois jours. Vérifiez les cellules et actualisez le support tous les deux jours.
À l’aide de ce protocole, des cellules épithéliales mammaires humaines ont été isolées du tissu mammaire. L’analyse post-isolement a montré que les cellules traitées avec l’inhibiteur de ROCK Y-27632 présentaient une croissance prononcée par rapport au groupe témoin. Le test CCK-8 a révélé que les cellules du milieu contenant de l’Y-27632 proliféraient à un taux significativement plus élevé que celles du milieu témoin.
Les tests d’immunofluorescence ont confirmé que la majorité des cellules exprimaient des marqueurs de cellules épithéliales mammaires, CK7 et GATA3, avec une présence négligeable d’autres types de cellules dans les passages ultérieurs. De plus, les études qRT-PCR ont montré des niveaux d’expression cohérents de CK7 et GATA3 sur plusieurs passages, indiquant un phénotype ou une capacité de différenciation cohérents.
