Pour commencer, utilisez une spatule pré-refroidie pour ajouter 100 milligrammes de poudre de tissu végétal dans un tube de microcentrifugation en polypropylène étagé. Ajoutez ensuite immédiatement un millilitre de méthanol à 20 % dans le tube. Placez le tube bouché sur un shaker à bascule pendant trois heures à température ambiante.
Ensuite, centrifugez le tube à 9 464 G pendant 10 minutes et recueillez le surnageant dans un flacon d’échantillonneur automatique LC-MS. Installez un instrument LC-MS avec une source d’ionisation par électronébulisation et une colonne HPLC en phase inverse. Pour la HPLC, utilisez 0,1 % d’acide formique dans l’eau comme solvant A et 0,1 % d’acide formique dans l’acétonitrile comme solvant B. Ajustez la température du four à colonne à 45 degrés Celsius et le débit à 0,5 millilitre par minute.
Équilibrez la colonne avec 99 % A et 1 % B. Établissez un gradient de 30 minutes pour que la concentration de solvant B augmente de 1 % à 50 % sur 26 minutes, puis revenez rapidement à 1 % B à 26,01 minutes et maintenez la position pendant quatre minutes. Configurez les paramètres de fonctionnement du spectromètre de masse.
Réglez la tension d’interface sur quatre kilovolts, le débit de gaz de nébulisation sur trois litres par minute et le débit de gaz de chauffage sur 10 litres par minute. Ajustez la température de la ligne de désolvatation à 250 degrés Celsius, la température du bloc chauffant à 400 degrés Celsius et la température de l’interface à 300 degrés Celsius. Réglez le débit de gaz de séchage à 10 litres par minute et la pression du gaz de dissociation induite par collision à 17 kilopascals.
Construire une méthode MS en mode positif de source d’ionisation par électronébulisation, inclure des balayages Q3 et Q1 couvrant la gamme de masse de 100 à 1 000 daltons, le balayage Q1 servant d’événement de relevé avec exclusion automatique des isotopes. Ajoutez un lien de balayage ionique produit au balayage Q1 avec une fenêtre de masse de 50 à 1 000 daltons, une énergie de cellule de collision de moins 20 volts et une durée d’événement inférieure à 0,2 seconde. Ensuite, ajustez la méthode MS pour ajouter des balayages d’ions précurseurs en mode positif égaux à la longueur de la méthode LC avec des énergies de cellule de collision de moins 20 volts et des durées d’événement de 0,75 seconde.
Assurez-vous que dans tous les cas, les fonctions d’exclusion ou de désisotopisation automatiques des isotopes sont activées. Définissez les valeurs de charge principale pour les fragments d’alcaloïdes tropanes monosubstitués, disubstitués et trisubstitués. Ensuite, à la méthode MS-MS, ajoutez des balayages de perte neutre en mode positif égaux à la longueur de la méthode LC avec des énergies de cellule de collision de moins 20 volts et des temps d’événement de 0,75 seconde.
Assurez-vous que dans tous les cas, les fonctions d’exclusion ou de désisotopation isotopiques automatiques sont activées. Configurez les masses de perte neutres d’intérêt pour les esters sur les alcaloïdes tropanes pour les esters dérivés de l’acide tiglique, des groupes acétyle et des esters phényllactiques ou d’acide tropique. Téléchargez la méthode LC-MS et créez des fichiers de données pour les échantillons d’intérêt.
Une fois la colonne HPLC équilibrée à 45 degrés Celsius, injectez 10 à 20 microlitres d’échantillon.
