Pour commencer, stérilisez la surface d’un coléoptère Monochamus alternatus et Tribolium castaneum affamé de 24 heures avec de l’eau de Javel, de l’éthanol et de l’eau distillée. Pour induire l’infection fongique, plongez d’abord les brindilles de pin ou le son de blé dans la suspension conidique pendant 10 secondes. Trempez ensuite les coléoptères dans la suspension conidiale.
Après séchage, placez un coléoptère et une brindille dans un tube stérile de 50 millilitres. Élevez les coléoptères dans un incubateur non humidifié à 25 degrés Celsius. Après l’incubation, transférez les coléoptères morts dans un nouveau tube de 50 millilitres et placez un morceau de coton stérile et humide dans le tube.
Disséquez les corps de coléoptères infectés par des infections fongiques dans des positions telles que les antennes, la tête, le thorax, l’abdomen, les ailes et les pattes. Coupez des bouchons de disque de cinq millimètres de colonies fongiques matures. Placez les tissus infectés du coléoptère dans du glutaraldéhyde à 2,5 % pré-refroidi à quatre degrés Celsius pendant deux jours.
Ensuite, lavez les échantillons trois fois dans un tampon de phosphate à 0,1 % pendant cinq minutes et déshydratez-les en augmentant les concentrations d’éthanol pendant 10 minutes chacun. Séchez les échantillons dans un lyophilisateur sous vide, puis observez les structures fongiques au microscope électronique à balayage. Traitez le son de blé avec une suspension conidie pendant 10 secondes et après séchage, transférez-le dans une boîte de Pétri.
Plongez les coléoptères T. castaneum dans la suspension conidique pendant 10 secondes avant de les placer dans la boîte de Pétri contenant du son de blé. Après l’incubation, comptez les coléoptères morts de l’assiette. Extrayez l’ADN génomique de champignons entomopathogènes parasites à l’aide du kit d’isolement d’ADN génomique de champignons.
À l’aide des ensembles d’amorces donnés, préparez un mélange de réaction PCR pour l’amplification spécifique du gène. Après le séquençage, alignez la séquence nucléotidique à l’aide de ClustalX 2. Enfin, effectuez une analyse phylogénétique à l’aide de MEGA 6 selon la méthode du maximum de vraisemblance.
Des champignons parasites comme Aspergillus austwickii, Akanthomyces attenuatus et Scopulariopsis alboflavescens ont provoqué des symptômes d’infection importants chez M. alternatus. Les observations MEB ont également confirmé les caractéristiques morphologiques de ces champignons parasites à la surface des coléoptères. L’activité entomopathogène a montré des taux de mortalité significativement plus élevés chez les champignons parasites par rapport au groupe témoin.
L’arbre phylogénétique multigénique a démontré des distances génétiques entre les trois espèces fongiques parasites et d’autres espèces au sein de leurs genres respectifs.
