Extraction et électroporation du cœur d’embryon de souris comme approche de transgenèse

Pour commencer, utilisez un extracteur de pipette pour étirer un capillaire en verre de 20 micromètres de large. Placez un utérus de souris extrait sur une serviette en papier sèche. Ensuite, insérez la pointe d’une paire de ciseaux fins dans le côté myométrial de l’utérus, et passez lentement le bord de la lame sur toute la longueur et coupez-la.

Maintenant, exposez et coupez le décidui. Transférez-les dans un plat avec du milieu de croissance. Disséquez les décidui pour extraire les embryons.

Transférez les embryons dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant un milieu de croissance chaud. À l’aide d’une paire de pinces fines, coupez soigneusement la queue et la tête de l’embryon et ne laissez que le tronc du corps. Retirez avec précaution autant de tissu que possible du tronc sans endommager le cœur ou les artères pulmonaires et aortales.

Insérez une nouvelle aiguille étirée dans l’extrémité de la pipette buccale, puis aspirez et chargez soigneusement 10 microlitres d’un mélange de plasmides préparé dans l’aiguille étirée. Placez un seul cœur dans une boîte de Pétri propre de 60 millimètres contenant du PBS préchauffé. Placez la parabole sous un microscope à dissection.

Ajustez la distance entre les pôles des électrodes positive et négative à environ quatre millimètres. Ensuite, utilisez une aiguille dans la pipette buccale pour percer doucement la couche la plus superficielle du cœur. Transférez un à deux microlitres du mélange plasmidique dans le cœur.

Retirez l’aiguille avec précaution. Maintenez l’électrode en place de manière à ce que le cœur soit situé entre les deux pôles. Ensuite, électroporez le cœur.

Transférez le cœur électroporé dans une nouvelle plaque à 12 puits, contenant un millilitre de milieu de croissance. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone jusqu’à l’analyse.