Cette étude a été financée par la subvention RTI2018-097617-J-I00 du Ministerio de Ciencia e Innovación espagnol et l’Acción 9 de l’Universidad de Jaén à l’O.H.O., la subvention PGC2018-096486-B-I00 du Ministerio de Ciencia e Innovación espagnol et la subvention H2020-MSCA-ITN-2016-722427 du programme Horizon 2020 de l’UE à M.T. JMG a été soutenue par une bourse de doctorat du ministère espagnol des Sciences et de la Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Le CNIC et le CBMSO sont tous deux soutenus par le ministère espagnol des Sciences, et le CNIC est soutenu par la Fondation ProCNIC.

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale du CNIC et conformes à la législation en vigueur, y compris la directive européenne 2010/63UE et la recommandation 2007/526/CE, telles qu’appliquées par la loi espagnole en vertu du décret royal 53/2013. Pour ce protocole, des souris CD-1 femelles de type sauvage âgées de 15 à 21 semaines ont été utilisées. Les détails concernant les animaux, les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Préparation du plasmide et de l’outil
<ol><li>Tout d’abord, préparez le mélange d’électroporation en ajoutant l’ADN plasmidique souhaité dans de la glace à une concentration finale de 1 μg/μL. Ensuite, complétez le mélange en ajoutant du saccharose à 6 % de concentration finale (dissous dans du PBS), un colorant biocompatible à 0,01 % et complétez avec du PBS jusqu’à un volume final de 30 μL. REMARQUE : Environ 1 à 2 μL du mélange d’électroporation est utilisé par échantillon. Échelonnez les proportions du mélange d’électroporation en fonction du nombre d’échantillons dans l’expérience. N’oubliez pas que l’ADN pour l’électroporation doit être purifié à partir de cultures bactériennes, assurant une stabilité optimale et un minimum de contaminants. Pour plus de détails sur les plasmides utilisés pour cette étude, veuillez vous référer à la section des résultats représentatifs.</li>
	<li>Préparez le milieu de croissance en complétant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 2 % de tampon Hepes et 1 % de pénicilline/streptomycine. Maintenir le milieu dans un incubateur à 37 °C jusqu’à l’utilisation. De plus, réchauffez 1x PBS à 37 °C, avec le milieu de croissance.</li>
	<li>Préparez les aiguilles en étirant un capillaire en verre de 20 μm de diamètre à l’aide d’un extracteur de pipette dans les conditions suivantes : chaleur = 550 ; traction = 100 ; vitesse = 250 ; temps = 120. Le diamètre final après le tirage doit être d’environ 5 à 8 μm.</li>
	<li>Réglez les paramètres de l’électroporateur sur cinq cycles de 50 ms à 40 V avec des intervalles de 900 ms. Préparez les électrodes, la pipette à bouche et l’aiguille émoussée (Figure 3A). Équipez la pipette de l’aiguille pour charger l’ADN (Figure 3A).</li>
</ol>2. Dissection d’embryons et extraction cardiaque
<ol><li>Mettez en place un croisement entre des souris CD-1 de type sauvage. Le lendemain matin, sélectionnez les femelles qui présentent un bouchon vaginal et notez cette heure comme jour embryonnaire E0.5. Euthanasier les animaux au jour embryonnaire E12-12.5 par luxation cervicale (selon les protocoles approuvés par l’établissement).</li>
	<li>Extrayez soigneusement l’utérus de la souris et placez-le dans une serviette en papier sèche. Ensuite, coupez l’utérus à l’aide de ciseaux fins en insérant la pointe des ciseaux dans le côté mésométrial et en passant lentement le bord de la lame sur toute la longueur. Exposez les déciduae et transférez-les dans le milieu de croissance. Pour plus de détails, veuillez consulter les travaux de Behringer et al.20.</li>
	<li>Disséquez les déciduae pour extraire les embryons, puis placez les embryons dans une boîte de Pétri de 60 mm avec un milieu de croissance chaud. À l’aide de pinces fines, coupez soigneusement la queue et la tête de l’embryon de manière à ce qu’il ne reste que le tronc du corps. Le stade des embryons peut être vérifié en évaluant les caractéristiques anatomiques, comme décrit par Wong et al.21.</li>
	<li>Ensuite, retirez avec précaution autant de tissu que possible du tronc de l’embryon sans endommager le cœur ou les artères pulmonaires et aortales. Une fois le cœur exposé, placez-le immédiatement dans un nouveau milieu de croissance chaud et conservez-le dans un incubateur à 37 °C jusqu’à l’électroporation. REMARQUE : Le maintien de la température cardiaque est crucial pour sa survie. Assurez-vous que le milieu est toujours chaud et remplacez-le toutes les 5 à 10 minutes. D’autre part, les échantillons peuvent être manipulés sans maintenir la stérilité, car cela n’affectera pas l’efficacité de la procédure. Veuillez noter que le milieu de croissance contient des antibiotiques.</li>
</ol>3. Électroporation cardiaque et culture ex vivo 
<ol><li>Chargez environ 10 μL de mélange plasmidique (préparé à l’étape 1.1) dans l’aiguille en aspirant soigneusement avec la pipette à bouche.</li>
	<li>Préparez un seul cœur pour l’électroporation en le plaçant dans une boîte de Pétri propre de 60 mm avec 1x PBS stérile chauffé à 37 °C. Placez la parabole sous le microscope à dissection (Figure 3A).</li>
	<li>Préparez les électrodes en ajustant la distance entre les pôles positif et négatif à environ 4 mm (Figure 3B). REMARQUE : 4 mm est la distance d’ouverture dans laquelle les cœurs de souris E12.5 s’insèrent dans les électrodes utilisées dans ce travail. Veuillez envisager de modifier cette distance en fonction de différentes tailles d’échantillons ou spécifications d’électrodes.</li>
	<li>Percez doucement la couche la plus superficielle du cœur avec l’aiguille dans la pipette à bouche. Pipetez soigneusement 1 à 2 μL du mélange plasmidique et retirez l’aiguille. Des injections multiples peuvent être effectuées pour assurer une pénétration optimale, ainsi que pour augmenter le nombre de cellules électroporées.</li>
	<li>Maintenez les électrodes en place de manière à ce que le cœur soit situé entre les deux pôles (Figure 3C). Ensuite, électroporez le cœur dans les conditions spécifiées ci-dessus. REMARQUE : Pour assurer une efficacité d’électroporation maximale, il est possible de changer la polarité des électrodes et de donner une autre impulsion.</li>
	<li>Transférez le cœur électroporé dans une nouvelle plaque à 12 puits contenant 1 mL de milieu de croissance et placez-le à 37 °C, 5 % de CO2.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.1 à 3.6 jusqu’à ce que tous les échantillons de l’expérience soient électroporés. Enfin, incubez tous les cœurs dans un incubateur à 37 °C, 5% CO2, pendant 24 h ou jusqu’à l’analyse. REMARQUE : Dans nos mains, les cœurs peuvent être laissés en culture jusqu’à 48 h sans signes apparents de détérioration (film supplémentaire 1 ; Film supplémentaire 2 ; Figure supplémentaire 1).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig03.jpg"> Figure 3 : Configuration de l’électroporation. (A) Configuration utilisée pour l’électroporation. Les flèches rouges indiquent l’électroporateur, les électrodes et la boîte de Pétri où les cœurs sont électroporés. (A') Détail rapproché de l’aiguille d’électroporation, comme le souligne (A) par le rectangle blanc. (B) Détail de la distance ajustée des électrodes utilisées dans les cœurs E12.5. (C) Représentation schématique de l’électroporation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
4. Tri cellulaire et analyse immunohistochimique
<ol><li>Pour l’analyse de tri cellulaire des échantillons, préparer un milieu de digestion pour dissocier les tissus en mélangeant 400 μL de libérase (5 mg/ml), 300 μL de dispase (0,1 g/mL), 4 μL de CaCl2(0,4 μM), 50 μL de MgCl2 (5 μM) et compléter jusqu’à 10 mL de DMEM. Garder sur la glace jusqu’à utilisation. Chaque cœur a besoin d’environ 1 ml de milieu de digestion. Ajustez les volumes en fonction du nombre d’échantillons. REMARQUE : Pour l’immunohistochimie, fixer directement les cœurs dans 1,5 mL de PFA à 4 % pendant 2 h à l’heure de l’artérologie ou toute la nuit à 4 °C. Le lendemain, lavez les cœurs 3 fois avec du PBS et procédez aux procédures histologiques et d’immunocoloration en aval. Pour un protocole d’immunohistochimie détaillé, veuillez consulter Morris et coll.22.</li>
	<li>Transférez chaque cœur en culture dans un nouveau tube contenant 1 mL de milieu de digestion glacé.</li>
	<li>Pour faciliter la dissociation, hachez le tissu en appliquant doucement le plaisir avec une seringue 3 à 4 fois et incubez immédiatement dans une plaque chauffante à 37 °C, 600 tr/min pendant 45 min.</li>
	<li>Filtrez le mélange de digestion à travers une passoire de 70 μm dans un nouveau tube et laissez-le se vider par gravité. Ensuite, récupérez le volume de passage et filtrez-le à nouveau à l’aide d’une crépine à cellules de 40 μm dans un nouveau tube de 50 mL.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de sérum fœtal bovin (FBS) et compléter jusqu’à 30 mL avec du DMEM froid.</li>
	<li>Centrifuger le mélange à 240 x g pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Jetez le surnageant et placez le tube de 50 ml à l’envers sur une serviette en papier pour qu’il sèche complètement. REMARQUE : Il s’agit d’un point pratique pour interrompre l’expérience en congelant la pastille de cellule. Si c’est le cas, remettre en suspension les cellules avec 10 % de DMSO dans le FBS et les stocker à -80 °C.</li>
	<li>Pour le tri cellulaire, remettre les cellules en suspension dans 300 μL de tampon de tri (1 % FBS, 1 % pénicilline/streptomycine dans le PBS) et ajouter 0,3 μL de DAPI (1000x). Effectuez le tri des cellules.</li>
</ol>

Transgenèse par électroporation de cellules cardiaques dans des cœurs de souris

<ol>
	<li>Tyser, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+handling+precedes+cardiac+differentiation+to+initiate+the+first+heartbeat.">Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat.</a> eLife. 5, e17113 (2016).</li><li>Tyser, R. C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+common+progenitor+pool+of+the+epicardium+and+myocardium.">Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium.</a> Science. 371 (6533), eabb2986 (2021).</li><li>Sendra, M., Dom&#237;nguez, J., Torres, M., Oca&#241;a, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+complexity+of+early+heart+progenitor+cells.">Dissecting the complexity of early heart progenitor cells.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5 (2021).</li><li>Ivanovitch, K., Temi&#241;o, S., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+heart+tube+development+in+mouse+reveals+alternating+phases+of+cardiac+differentiation+and+morphogenesis.">Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis.</a> eLife. 6, e30668 (2017).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+signaling+functions+in+second+heart+field+to+promote+right+ventricular+growth.">Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth.</a> PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).</li><li>Zimmerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+burden+of+congenital+heart+disease,+1990-2017:+A+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).</li><li>Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mending+broken+hearts:+Cardiac+development+as+a+basis+for+adult+heart+regeneration+and+repair.">Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Cao, J., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicardium+as+a+hub+for+heart+regeneration.">The epicardium as a hub for heart regeneration.</a> Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors.">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li><li>Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+from+activated+epicardium.">Cardiac regeneration from activated epicardium.</a> PLOS One. 7 (9), e44692 (2012).</li><li>Hesse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+defines+heterogeneity+of+epicardial+cells+and+fibroblasts+within+the+infarcted+murine+heart.">Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart.</a> eLife. 10, e65921 (2021).</li><li>Streef, T. J., Smits, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+contribution+to+the+developing+and+injured+heart:+Exploring+the+Cellular+composition+of+the+epicardium.">Epicardial contribution to the developing and injured heart: Exploring the Cellular composition of the epicardium.</a> Front Cardiovasc Med. 8, 750243 (2021).</li><li>Sanchez-Fernandez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+epicardial+cell+heterogeneity+during+cardiogenesis+and+heart+regeneration.">Understanding epicardial cell heterogeneity during cardiogenesis and heart regeneration.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 10 (9), 376 (2023).</li><li>Quijada, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+endothelial+cell+positioning+and+fate+specification+by+the+epicardium.">Coordination of endothelial cell positioning and fate specification by the epicardium.</a> Nat Commun. 12 (1), 4155 (2021).</li><li>Mantri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+single-cell+RNA+sequencing+of+developing+chicken+hearts+identifies+interplay+between+cellular+differentiation+and+morphogenesis.">Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis.</a> Nat Commun. 12 (1), 1771 (2021).</li><li>Paul, S., Zhang, X., He, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeobox+gene+Meis1+modulates+cardiovascular+regeneration.">Homeobox gene Meis1 modulates cardiovascular regeneration.</a> Semin Cell Dev Biol. 100, 52-61 (2020).</li><li>Stankunas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pbx/Meis+deficiencies+demonstrate+multigenetic+origins+of+congenital+heart+disease.">Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease.</a> Circ Res. 103 (7), 702-709 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+Meis1+act+as+a+new+regulator+of+ischemic+arrhythmias+in+mice.">Transcription factor Meis1 act as a new regulator of ischemic arrhythmias in mice.</a> J Adv Res. 39, 275-289 (2022).</li><li>Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2014).</li><li>Wong, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+atlas+of+the+mouse+embryo+for+precise+morphological+staging.">4D atlas of the mouse embryo for precise morphological staging.</a> Development. 142 (20), 3583-3591 (2015).</li><li>Morris, L., Klanke, C., Lang, S., Lim, F. Y., Crombleholme, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TdTomato+and+EGFP+identification+in+histological+sections:+Insight+and+alternatives.">TdTomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives.</a> Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).</li><li>Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+myosins:+expression+patterns+and+functional+significance.">Developmental myosins: expression patterns and functional significance.</a> Skelet. Muscle. 5 (1), 22 (2015).</li><li>Eissa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+reference+genes+for+messenger+RNA+quantification+by+real-time+pcr+in+mouse+dextran+sodium+sulfate+experimental+colitis.">Stability of reference genes for messenger RNA quantification by real-time pcr in mouse dextran sodium sulfate experimental colitis.</a> PLOS One. 11 (5), e0156289 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2&#8722;&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2&#8722;&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Lai, S. R., Andrews, L. G., Tollefsbol, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+using+a+plasmid+construct+expressing+short-hairpin+RNA.">RNA interference using a plasmid construct expressing short-hairpin RNA.</a> Methods Mol Biol. 405, 31-37 (2007).</li><li>Carmona, R., Barrena, S., L&#243;pez Gambero, A. J., Rojas, A., Mu&#241;oz-Ch&#225;puli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+cell+lineages+and+the+origin+of+the+coronary+endothelium.">Epicardial cell lineages and the origin of the coronary endothelium.</a> FASEB J. 34 (4), 5223-5239 (2020).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P. F. M., Mentink, M. M. T., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cells+contribute+a+novel+population+to+the+myocardial+wall+and+the+atrioventricular+cushions.">Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions.</a> Circ Res. 82 (10), 1043-1052 (1998).</li><li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+types,+methods+and+strategies:+A+technical+review.">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> Peer J. 9, e11165 (2021).</li><li>Ka&#322;u&#380;na, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+human+heart+ex+vivo-Current+possibilities+and+strive+for+future+applications.">Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications.</a> JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).</li><li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis.">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ex+vivo+culture+method+for+the+embryonic+mouse+heart.">A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart.</a> J Vis Exp. 75, e50359 (2013).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Dans l’ensemble, la méthodologie décrite ici offre un cadre robuste pour l’expression des constructions transgéniques dans l’épicarde en développement (Figure 4B), comme le démontre la surexpression de Meis1 (Figure 4C). Avec les constructions appropriées, ce protocole peut être utilisé pour évaluer transitoirement l’impact du gain de fonction (GOF) ou de la perte de fonction (LOF) d’un gène spécifique. Le LOF peut être implémenté dans l...

Le cœur est le premier organe formé au cours du développement embryonnaire. Ce processus implique la coordination spatio-temporelle de diverses populations de cellules progénitrices à partir de zones distinctes de l’embryon. Tout cela se produit pendant que le cœur en développement continue de battre et de fonctionner, mettant l’accent sur la coordination remarquable nécessaire à sa formation 1,2,3. Compte tenu du rôle crucial du cœur, une régulation stricte aux niveaux cellulaire et moléculaire est essentielle à sa bonne formation 4,5. L’identification des mécanismes qui contrôlent le développement cardiaque a été d’un grand intérêt, car ils sont cruciaux pour démêler les cardiopathies congénitales, qui touchent un nombre important de patients dans le mondeentier 6. De plus, la compréhension du développement cardiaque est essentielle pour déchiffrer la régénération cardiaque, car les cœurs postnatals des mammifères conservent une capacité de régénération qui est perdue ou entravée à l’âge adulte 7,8. Par conséquent, il est impératif de disséquer les régulateurs moléculaires du développement cardiaque pour faire progresser les efforts de recherche sur les cardiopathies congénitales et la régénération cardiaque.
Dans la poursuite de cet objectif, on s’est de plus en plus intéressé à l’étude du rôle de l’épicarde dans le développement et la régénération cardiaques9. L’épicarde est une fine couche de tissu mésothélial qui comprend la couche la plus externe du cœur de mammifère (Figure 1). Des études récentes ont montré l’importance de l’épicarde lors d’une lésion cardiaque, révélant que ce tissu est capable d’envoyer des signaux de prolifération aux cardiomyocytes de la zone touchée pour atténuer les dommages10,11. Malgré l’importance de l’épicarde, son immense hétérogénéité a été difficile à mener d’autres études moléculaires. Des expériences de RNAseq sur cellule unique ont révélé l’hétérogénéité de l’épicarde, abritant plusieurs sous-populations cellulaires avec des signatures transcriptomiques distinctes 12,13,14,15,16. Ainsi, une stratégie de dépistage des régulateurs potentiels du développement cardiaque devrait tenir compte de la diversité des cellules progénitrices épicardiques.
En ce sens, la facilité de modification génétique du modèle murin a facilité l’identification de nombreux gènes cruciaux pour le développement cardiaque, permettant la génération de lignées mutantes avec gain de fonction (GOF) ou perte de fonction (LOF) de gènes spécifiques. Cependant, ces approches impliquent un investissement considérable en temps et en moyens expérimentaux ; Par conséquent, ils ne sont pas pratiques lorsqu’il s’agit d’évaluer les rôles d’un grand nombre de gènes candidats. En outre, les gènes du développement exercent souvent des fonctions pléiotropiques dans différents tissus ou sont nécessaires au développement embryonnaire précoce, ce qui entrave l’interprétation de leur contribution au développement dans un processus spécifique. Bien qu’il soit possible de cibler la fonction des gènes à des structures spécifiques ou à des moments de développement, cela nécessite généralement l’utilisation de constructions génétiques plus complexes, qui peuvent être difficiles à générer ou qui sont généralement indisponibles.
Pour surmonter ces limitations, nous présentons une méthodologie permettant d’électropoler des cœurs embryonnaires de souris pour une transgenèse transitoire (Figure 2). Associée à la culture ex vivo et au tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), cette stratégie démontre ses capacités grâce au GOF transitoire de Meis1, un gène bien caractérisé impliqué dans le développement et la régénération cardiaques 17,18,19. Dans cet article, d’autres applications potentielles de cette méthodologie sont également explorées, et ses avantages et limites sont discutés, ainsi que comparés aux protocoles existants pour moduler transitoirement l’expression des gènes. Nous pensons que le cadre et les exemples visuels présentés amélioreront la compréhension de la biologie de l’épicarde au cours du développement et de la maladie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig01v2.jpg"> Figure 1 : Couches cardiaques embryonnaires de souris. Schéma de principe d’une vue coronale d’un cœur embryonnaire de souris E13-14. Les trois principales couches cellulaires du cœur sont représentées en jaune (endocarde), rouge (myocarde) et bleu (épicarde). Le péricarde est représenté par une ligne brune. Les quatre cavités du cœur sont abrégées en VG, ventricule gauche ; VD, ventricule droit ; LA, oreillette gauche ; RA, oreillette droite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig02.jpg"> Figure 2 : Vue d’ensemble schématique du protocole d’électroporation cardiaque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm vise table&#160;</td>
			<td>Grandado</td>
			<td>SKU 8798771617573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Policlonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10262</td>
			<td>1:1000 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-6503-82</td>
			<td>1:500 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 Wild Type mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Animalary Unit (CNIC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>9661</td>
			<td>1:400 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4083</td>
			<td>1:1000 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase/collagenase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51032720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Stereoscopic Microscope S8AP0</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11524102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller Model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>SU-P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#89689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 &#215; 10 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 60 &#215; 15 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reused from old laboratory equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td>9979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>1:300 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Wave Electroporator CUY21SC</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY664-10X15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided and autoclaved by technical unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes with variable gap</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY650P5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient transgenesis approach for gene delivery in the mouse embryonic heart

Le cœur de mammifère est un organe complexe formé au cours du développement par des populations très diverses de cellules progénitrices. L’origine, le moment du recrutement et le destin de ces géniteurs sont essentiels au bon développement de cet organe. Les mécanismes moléculaires qui régissent la morphogenèse du cœur sont essentiels pour comprendre la pathogenèse des cardiopathies congénitales et de la régénération cardiaque embryonnaire. Les approches classiques pour étudier ces mécanismes utilisaient la génération de souris transgéniques pour évaluer la fonction de gènes spécifiques au cours du développement cardiaque. Cependant, la transgenèse chez la souris est un processus complexe et long qui ne peut souvent pas être effectué pour évaluer le rôle de gènes spécifiques au cours du développement cardiaque. Pour y remédier, nous avons développé un protocole d’électroporation et de culture efficaces de cœurs embryonnaires de souris, permettant la transgenèse transitoire pour évaluer rapidement l’effet du gain ou de la perte de fonction des gènes impliqués dans le développement cardiaque. En utilisant cette méthodologie, nous avons réussi à surexprimer Meis1 dans le cœur embryonnaire, avec une préférence pour la transfection des cellules épicardiques, démontrant ainsi les capacités de la technique.

The heart is the first organ formed during embryonic development. This process involves the spatiotemporal coordination of various populations of progenitor cells from distinct areas of the embryo. All this occurs while the developing heart continues to beat and function, emphasizing the remarkable coordination required for its formation1,2,3. Given the crucial role of the heart, tight regulation at the cellular and molecular levels is essential for its proper formation4,5. Identifying the mechanisms that control heart development has been of great interest, as they are crucial for unraveling congenital heart disorders, which impact a substantial number of patients worldwide6. Furthermore, comprehending heart development is pivotal in deciphering cardiac regeneration, as postnatal mammalian hearts retain a regenerative capacity that is lost or hindered in adulthood7,8. Consequently, dissecting molecular regulators of heart development is imperative to advance research efforts on congenital heart disease and cardiac regeneration.
In pursuit of this objective, there has been a growing focus on investigating the role of the epicardium in cardiac development and regeneration9. The epicardium is a thin layer of mesothelial tissue that comprises the outermost layer of the mammalian heart (Figure 1). Recent studies have shown the importance of the epicardium during cardiac injury, revealing that this tissue is able to send proliferation signals to cardiomyocytes in the affected area to mitigate the damage10,11. Despite the importance of the epicardium, conducting further molecular investigations has been challenged by its immense heterogeneity. Single-cell RNAseq experiments have revealed the epicardium&#39;s heterogeneity, housing multiple cell subpopulations with distinct transcriptomic signatures12,13,14,15,16. Thus, a strategy to screen potential regulators of cardiac development should accommodate the diversity of epicardial progenitor cells.
In this sense, the mouse model&#39;s amenability to genetic modification has facilitated the identification of numerous genes crucial for heart development, allowing the generation of mutant lines with gain-of-function (GOF) or loss-of-function (LOF) of specific genes. However, these approaches imply a considerable investment of time and experimental resources; therefore, they are impractical when assessing the roles of a large number of candidate genes. Besides, developmental genes often exert pleiotropic functions in different tissues or are required for early embryonic development, hampering the interpretation of their contribution to development in a specific process. While it is possible to target gene function at specific structures or developmental time points, this usually requires the use of more complex genetic constructions, which can be difficult to generate or are generally unavailable.
To overcome these limitations, we present a methodology to electroporate mouse embryonic hearts for transient transgenesis (Figure 2). Paired with ex vivo culture and fluorescence-activated cell sorting (FACS), this strategy demonstrates its capabilities through transient GOF of Meis1, a well-characterized gene implicated in heart development and regeneration17,18,19. In this article, other potential applications of this methodology are also explored, and its advantages and limitations are discussed, as well as compared to existing protocols for transiently modulating gene expression. We believe the framework and visual examples presented will enhance the understanding of epicardium biology during development and disease.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Mouse embryonic heart layers. Schematic diagram of a coronal view of an E13-14 mouse embryonic heart. The three main cellular layers of the heart are represented in yellow (endocardium), red (myocardium), and blue (epicardium). The pericardium is represented in a brown line. The four chambers of the heart are abbreviated as LV, left ventricle; RV, right ventricle; LA, left atrium; RA, right atrium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig02.jpg" /> 
Figure 2: Schematic overview of the heart electroporation protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Pleins feux sur l’auteur : Transgénèse cellulaire cardiaque pour le dépistage rapide des gènes

Une approche de transgenèse efficace pour l’administration de gènes dans le cœur embryonnaire de souris

We aim to establish a new methodology that facilitates the overexpression or downregulation of a certain gene to understand heart development. Mouse transgenesis is a great investment of time and effort. Assessing genes one by one is not realistic because of this and also because of the high complexity of the genome.Hence, there is a need for a rapid method of screening. We have presented a tool available to any researcher to analyze the gain or loss of function of a candidate gene during heart development. The main advantage of our protocol is that it's much quicker and less expensive than mouse transgenesis.Perhaps it could be used to assess different genes of interest before commencing a transgenesis experiment.

Pour démontrer l’efficacité de cette technique dans la réalisation d’expériences de gain de fonction (GOF) pour les régulateurs du développement cardiaque pertinents, une construction a été électroporée surexprimant le facteur de transcription Meis1. Pour ce faire, l’ARN a été extrait d’embryons E9.5, et une transcription inverse a été effectuée pour obtenir de l’ADN complémentaire (ADNc). En utilisant l’ADNc comme modèle, la séquence codante de Meis1 a été clonée (tableau supplé...

Ce protocole présente un cadre méthodologique détaillé pour la transgenèse des cellules cardiaques basée sur l’électroporation dans les cœurs de souris en développement. Les ressources vidéo fournies ici faciliteront l’apprentissage de cette technique polyvalente.

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

an-efficient-transgenesis-approach-for-gene-delivery-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

409 vues.  Severo Ochoa Center for Molecular Biology (CBMSO). Notre objectif est d’établir une nouvelle méthodologie qui facilite la surexpression ou la régulation négative d’un certain gène pour comprendre le développement cardiaque. La transgénèse de la souris est un grand investissement de temps et d’efforts. Évaluer les gènes un par un n’est pas réaliste pour cette raison et aussi en raison de la grande complexité du génome.Par conséquent, il est nécessaire de disposer d’une méthode ...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Transgénèse cellulaire cardiaque pour le dépistage rapide des gènes

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

Recherche

Biologie du développement

Extraction and Electroporation of Mouse Embryo Heart as a Transgenesis Approach

To begin, use a pipette puller to stretch a 20 micrometer wide glass capillary. Place an extracted mouse uterus on a dry paper towel. Then, insert the tip of a pair of fine scissors into the myometrial side of the uterus, and slowly run the edge of the blade through the whole length and cut it.Now, expose and cut the decidui. Transfer them into a dish with growth medium. Dissect the decidui to extract the embryos.Transfer the embryos into a 60 millimeter Petri dish containing warm growth medium. With a pair of fine forceps, carefully cut the tail and the head of the embryo, and leave only the trunk of the body. Carefully remove as much tissue as possible from the trunk without damaging the heart or pulmonary and aorta arteries.Insert a new stretched out needle into the tip of the mouth pipette, and carefully aspirate and load 10 microliters of a prepared plasmid mix into the stretched out needle. Place a single heart into a clean 60 millimeter Petri dish containing prewarmed PBS. Place the dish under a dissecting microscope.Adjust the distance between the poles of positive and negative electrodes to about four millimeters. Next, use a needle in the mouth pipette to gently puncture the most superficial layer of the heart. Transfer one to two microliters of the plasmid mix into the heart.Remove the needle carefully. Hold the electrode in place so that the heart is located between both poles. Then, electroporate the heart.Transfer the electroporated heart to a new 12 well plate, containing one milliliter of growth medium. Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide until analysis.

Extraction et électroporation du cœur d’embryon de souris comme approche de transgenèse

Electroporated Mouse Cardiac Cell Isolation for Cell Sorting and Analysis

To begin, obtain electro operated mouse hearts extracted from wild type CD1 mice, 12 to 12.5 days after crossing. Transfer a heart into a tube containing one milliliter of ice cold digestion medium. With a syringe, apply gentle pressure on the heart a few times to chop it.Incubate the chopped tissue on a hot plate at 37 degrees Celsius for 45 minutes at 600 rotations per minute. Then filter the digestion mixture through a 70 micrometer cell strainer into a new tube. Next, filter the pass through volume again with a 40 micrometer cell strainer into a new 50 milliliter tube.Pipette 500 microliters of the FBS into the filtrate. Make up the volume up to 30 milliliters with cold DMEM. Centrifuge the suspension at 240G for 10 minutes at room temperature.Discard the supernatant. Then place the tube upside down on a paper towel to dry completely. For cell sorting, resuspend the cells in 300 microliters of sorting buffer.Finally, add 0.3 microliters of DAPI and perform cell sorting. The hearts were beating and appeared to be in good condition 24 hours post electroporation. The myocardium and epicardium did not show any signs of apoptosis.Analysis of the fluorescence activity showed a mosaic GFP signal in almost all four chambers of the heart.