Après avoir effectué l’immunohistochimie sur les tissus FFPE, imagez les coupes à l’aide de l’imageur de pathologie numérique. Lancez le logiciel pour effectuer le démixage spectral des images annotées. Sélectionnez Fichier, puis cliquez sur Ouvrir l’image, puis choisissez les fichiers QPTIFF pour télécharger les images dans le logiciel.
Autorisez les tampons marqués comme projets informés à télécharger dans le projet. Chargez les fichiers QPTIFF préparés pour la compensation d’autofluorescence. Sélectionnez l’autofluorescence sur l’outil d’image pour tracer une ligne sur l’image à partir de la lame non colorée à travers des structures autofluorescentes telles que les érythrocytes et le collagène pour compenser l’autofluorescence.
Accédez ensuite à la section Modifier les marqueurs et les couleurs. Attribuez des noms de marqueur qui correspondent au fluorophore Opal et ajustez les paramètres de couleur selon votre option préférée. Sélectionnez Préparer tout situé dans le coin inférieur gauche de l’interface pour lancer le démélange des fluorophores.
Examinez toutes les images pour vérifier la visibilité de tous les signaux et la bonne fin du processus de démixage. Sélectionnez l’icône du globe oculaire pour éteindre et rallumez tous les marqueurs un par un pour vérifier la qualité. Naviguez maintenant vers l’onglet Exporter et créez un nouveau répertoire d’exportation vide en cliquant sur le bouton Parcourir situé sous le répertoire d’exportation.
Sélectionnez l’image composite et les images de composant multi-images TIFF sous l’onglet images à exporter. Accédez à l’onglet Analyse par lots situé verticalement sur la gauche pour le traitement par lots des diapositives et sélectionnez Créer des répertoires distincts pour chaque élément sous les options d’exportation. Pour ajouter des diapositives à analyser, sélectionnez des fichiers QPTIFF sous le bouton Ajouter des diapositives et chargez-les dans l’analyse par lots.
Sélectionnez Exécuter pour commencer le traitement par lots des diapositives. Créez un nouveau dossier contenant uniquement les fichiers de composant issus du démixage spectral, en veillant à ce que la structure hiérarchique des dossiers reste intacte. Lancez l’ensemble du logiciel de visualisation de diapositives.
Cliquez sur Créer un projet sur le côté gauche et créez ou sélectionnez un nouveau dossier vide avec un nom approprié. Cliquez ensuite sur Automatiser et choisissez Afficher l’éditeur de script. Copiez et collez le script existant et modifiez l’emplacement pour le diriger vers le dossier qui contient tous les fichiers de composant de diapositive.
Sélectionnez Exécuter pour commencer le processus d’assemblage par lots des diapositives, puis laissez-le se terminer. Déplacez maintenant les fichiers TIFF OME récemment générés dans le projet QuPath et enregistrez-les en tant que nouveau projet. Lorsqu’une nouvelle fenêtre apparaît, sélectionnez Définir le type d’image sur la fluorescence, puis cliquez sur le bouton Importer.
Naviguez jusqu’au menu de gauche, sélectionnez un échantillon dans la liste et double-cliquez pour ouvrir l’échantillon choisi. Ajustez l’intensité des canaux en cliquant sur l’icône Contraste pour améliorer la visibilité. Sélectionnez toutes les chaînes et choisissez de réinitialiser.
Assurez-vous que l’autofluorescence est désactivée. Pour dessiner une région d’intérêt ou un retour d’intérêt pour la tumeur, cliquez à nouveau sur l’icône de contraste, puis sélectionnez Afficher les niveaux de gris. Après cela, sélectionnez le canal marqueur de la tumeur et ajustez l’intensité pour une visibilité optimale.
Cliquez sur l’outil pinceau pour dessiner une ROI autour de la tumeur. Cliquez sur l’outil et ajustez le retour sur investissement tout en appuyant sur la touche alt pour lisser le retour sur investissement de l’extérieur. Une fois terminé, fusionnez toutes les parties séparées de la tumeur dans le même retour sur investissement.
Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’annotation de retour sur investissement dans la liste de gauche, sélectionnez Définir les propriétés et fournissez un nom approprié. Par exemple, Tumeur. Développez le retour d’intérêt de la marge invasive de la région tumorale en sélectionnant Objets, puis Annotations, puis Développer les annotations.
Choisissez la taille souhaitée pour le rayon d’expansion. Sélectionnez Supprimer l’intérieur et Limiter au parent. Cliquez sur l’icône de contraste, sélectionnez le canal d’autofluorescence et ajustez l’intensité pour une visibilité optimale.
Cliquez sur la baguette et ajustez le retour sur investissement tout en appuyant sur la touche alt pour lisser le retour sur investissement de l’extérieur et supprimer tout arrière-plan qui ne devrait pas faire partie de ce retour sur investissement. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’annotation dans la liste de gauche. Sélectionnez ensuite Définir les propriétés pour attribuer un nom approprié, tel que marge invasive ou IM au retour sur investissement.
Si vous le souhaitez, changez sa couleur. Pour exporter les annotations, accédez à l’option Fichier, cliquez sur Données d’objet, Exporter au format GeoJSON, puis sélectionnez Exporter tous les objets. Conservez la sélection par défaut lors de l’exportation en tant que collection de fonctionnalités et enregistrez-la à l’emplacement de votre choix.
